叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。实际上,其他的多种外植体,例如茎段、叶柄、胚轴、子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的方法进行转化。该方法的优点是适用性广且操作简单,是目前应用最多的方法之一。
原生质体共培养转化法:
原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞,通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养,然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后,置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞,进而再生成植株。与叶盘转化法相比,此法得到的转化体不含嵌合体,一次可以处理多个细胞,得到相对较多的转化体。应用此法进行基因转化时,其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术体系。
整株感染法:
此法是模仿根癌农杆菌天然的感染过程,用根癌农杆菌直接感染植物而进行遗传转化的一种简单易行的方法。其做法是:人为地在植株上造成创伤,然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上,或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。为了获得较高的转化频率,一般多采用无菌种子的实生苗或试管苗。用去除了致瘤基因的根癌农杆菌进行整株感染后,受伤部位一般不会出现肿瘤。在筛选转化体时,可将感染部位的薄壁组织切下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导再生植株。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)上,将根癌农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙,可长出转化
的新枝条,新的转化枝条开花结实后,也可以获得转基因种子;或者通过真空渗透或农杆菌
浸泡拟南芥开花植株,等结实之后,利用筛选萌芽种子的方法,也可以得到转基因植株及种
子。
2 发根农杆菌介导转化法
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是与根癌农杆菌同属的一种病原土壤杆菌。但与根癌农杆菌不同的是,发根农杆菌从植物伤口入侵后,不能诱发植物产生冠瘿瘤,而是诱发植物产生许多不定根。这些不定根生长迅速,不断分枝成毛状,故称之为毛状根或发状根(hairy root)。发状根的形成是由存在于发根农杆菌中的Ri质粒(root inducing plasmid,根诱导质粒)所决定的。
Ri 质粒是发根农杆菌染色体外的遗传物质。属于巨大质粒,其大小为200~800kb。Ri质粒和Ti 质粒不仅结构、特点相似,而且具有相同的寄主范围和相似的转化机理。与Ri质粒转化相关的也主要为Vir区和T-DNA区2部分。Ri质粒的T-DNA也存在冠瘿碱合成基因,且这些合成基因只能在被侵染的真核细胞中表达。根据其诱导的冠瘿碱的不同,Ri 质粒可分为3 种类型:农杆碱型(agropine)、甘露碱型(mannopine)和黄瓜碱型(cucumopine)。与Ti质粒的T-DNA不同的是,Ri质粒的T-DNA上的基因不影响植株再生。因此,野生型Ri质
粒可以直接作转化载体。
与Ti 质粒相同,Ri质粒基因转化载体的构建也主要采用有共整合载体和双元载体系统。由Ri 质粒诱发产生的不定根组织,经离体培养后,一般都可再生完整的植株。因此,利用Ri质粒作为转基因植物的载体,同样具有诱人的前景。
3 病毒介导转化法
病毒侵染细胞后把其DNA 导入寄主细胞,并且这些病毒DNA 能在寄主细胞中进行复制和表达。其本身就是一种潜在的基因转化系统。因此,病毒可以作为植物转基因的一种载体。随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入,用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视。因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中,而且不受单子叶或双子叶的限制。
在已知的300 多种植物病毒中,单链RNA 病毒约占91%左右,双链DNA 病毒、单链DNA病毒各占3%左右。RNA不太适合于作为克隆载体,因为RNA的操作非常困难。目前较为成熟的植物病毒载体是花椰菜花斑病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)和番茄金花叶病毒(tomato golden mosaic virus, TGMV)。
(1)CaMV DNA载体转化法
CaMV含有双链DNA基因组,将外源目的基因插入到CaMV DNA上,重组分子在体外包装成有感染力的病毒颗粒,就可高效转染植物原生质体,进而通过原生质体培养再生为整株植物。但CaMV 作为基因转化的载体也存在如下缺点,从而限制了其应用:①CaMV容纳外源DNA 的能力非常有限,即使是切除了非必须序列,也只能插入很小的片段;②CaMV 的寄主范围非常窄,主要是芸苔属(Brassica)植物如甘蓝和花椰菜等;③CaMV 是一种病原体,它的感染后会使寄主植物患病,降低产量和品质;④目前还没有发现有一种植物病毒DNA是可以整合到寄主染色体上的。这就不可能通过有性过程将插入的外源基因稳定地传递给感染植株的后代。⑤尽管CaMV DNA 可以感染植物,而带有外源基因的CaMVDNA 重组体则不能感染植物,这就必须通过原生质体予以克服。但通过原生质体再生植株对有些作物是非常困难的。并且植物病毒在植物组织中的传播也是受到限制的;⑥目前判断CaMV DNA感染的唯一的办法就是靠“症状”的表现,因此,对CaMV DNA载体来说,还需要一个更好的选择标记。


