中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体(如pBR322 质粒)中插入了一段合适的T-DNA片段而构成的小型质粒。
（4）中间载体的表达构建
在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子，可使外源基因在植物细胞中表达；当启动子与显性选择标记基因及报告基因连接，构成嵌合基因(chimeric gene)时，这些标记基因同样能表达，从而可提供用于筛选和鉴定的表型。这类含植物启动子的中间载体称为中间表达载体(intermediate expression vector)。
目前已从动物、植物、病毒及微生物中分离到许多适用于植物的启动子。根据作用方式及功能可将启动子分为3 类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。
①组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。目前使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子、来自根癌农杆菌Ti 质粒T-DNA 区域的胭脂碱合成酶基因Ocs 启动子，后者虽来自细菌，但具有植物启动子的特性。
②组织特异启动子(tissue-specific promoter)又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。例如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29，豌豆的豆清蛋白(leguimin)基因启动子可在转化植物种子中特异性表达，马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因启动子在块茎中优势表达。
③诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。
目前植物基因工程中常采用的终止子是胭脂碱合成酶的nos终止子和Rubisco小亚基基因的3′端区域。
（5）植物表达载体的构建
中间表达载体是不能将外源基因转化进植物细胞。因此，必须将中间表达载体引入到上述已改造的受体Ti 质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体(它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基因转化中应用。为利用根癌农杆菌的Ti 质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与Ti 质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti 质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA 重组分子就可整合到植物细胞染色体DNA 上。
最后利用植物选择标记基因筛选转化细胞。简单而言，一元载体系统就是指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti 质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体(co-integrated vector)；由于该载体的T-DNA区与Ti 质粒Vir 区连锁，因而又称为顺式载体(cis-vector)。
双元载体(binary vector)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。其中之一是含有T-DNA转移所必需的Vir 区段质粒，它缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活T-DNA 的转移，故称为辅助Ti 质粒(helper Ti plasmid)；另一个则是含有T-DNA的质粒。一般作为目的基因的载体，由于其分子量较小，故称为微型质粒(mini-Ti plasmid)。它是一种寄主范围广泛的DNA转移载体质粒。它既含有大肠杆菌复制起始位点，又含有根癌农杆菌复制起始位点，实际上是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。这两种质粒在单独存在的情况下，均不能诱导植物产生冠瘿瘤。若根癌农杆菌细胞内同时存在这两种质粒时，便可获得正常诱导肿瘤的能力。因此，含有双元载体的根癌农杆菌细胞浸染植物时，就可以将含有目的基因的T-DNA整合进植物基因组中。
目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti 质粒介导的双元载体系统。首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌后，再导入携带辅助Ti 质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti 质粒上的vir基因，随后将微型质粒上的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。由于双元载体系统的T-DNA和Vir 区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体(trans-vector)。
（6）Ti 质粒介导的转移转化方法
目前已建立了多种根癌农杆菌Ti 质粒介导的植物基因转化方法，其基本程序包括：含重组Ti 质粒的根癌农杆菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培养，转化植株再生等步骤。
叶盘转化法：
叶盘转化法(leaf dish transformation)是Monsanto公司Morsch等人(1985)建立起来的一种转化方法。其操作步骤为：首先用打孔器从消毒叶片上取下直径为2～5mm 圆形叶片，即叶盘。再将叶盘放入培养至对数生长期的根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌浸染叶盘。
然后用滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将这种经浸染处理过的叶盘置于培养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄青霉素抑菌剂的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株。对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合有目的基因及其表达情况。
