生物秀首页 新闻前沿 产业资讯 实验技术 仪器教程 生物考研 资源下载 生物人 物秀商城 生物论坛 图片 专业 博客 易生物 视频动画
生命科学实验中心
导航: 生物秀 > 实验 > DNA 实验 > 其它实验 > 正文
  • 倾力提供最优!
  • 生物秀实验频道
植物转基因技术
作者:王永飞 来源:生物秀 时间:2006-9-4

    (一) 转基因植株的PCR检测
    1 植物基因组DNA的提取
    1) 取4 g植株,在液氮中研磨成粉末(越细越好)。
    2) 转移至50 ml 离心管中,加入16 ml 提取液,充分混匀。65℃水浴保温20 min。
    3) 加入5ml 5M KAc溶液,冰浴放置30min以上。
    4) 加入5ml氯仿:苯酚(1﹕1),混匀。6000rpm离心10min。
    5) 上清液转移到一个干净的5mL离心管中,加入5ml氯仿,6000rpm离心10min
    6) 上清液转移到一个干净的5mL 离心管中,加入等体积冰冻的异丙醇。-20℃放置2h以上,沉淀DNA。4℃,6000rpm离心10min。弃上清液。
    7) 用70%乙醇洗涤沉淀2~3 次,吹干。
    8) 沉淀用TE 缓冲液溶,用分光光度法测A260及A280以确定浓度,于-20℃贮存备用。
    2 根癌农杆菌质粒提取
    1) 将3ml农杆菌菌液倒入离心管中,7, 000rpm离心1min。去掉上清液,沉淀悬于200μLSolution I 中。
    2) 加入300μL Solution II,混匀,冰浴5min。
    3) 加入300μL Solution III,混匀,冰浴5min。
    4) 加800μL氯仿,混匀,13, 000rpm离心15min,取上清液。
    5) 上清液中加入预冷的等体积异丙醇,-20℃沉淀30min。
    6) 13,000rpm离心15min。去上清,沉淀加入500μL 70%乙醇洗涤2 次。
    7) 13,000rpm离心3 分钟,去乙醇。
    8) 每管中加入38μL无菌水2μLRNase, 37℃消化。
    9) 电泳检测质粒,用分光光度法测A260及A280 以确定浓度,于-20℃贮存备用。
    3 PCR扩增
    1) PCR反应液
    转基因植物、对照植物和根癌农杆菌质粒DNA(0.01~0.5μg)作PCR反应模板,每个离心管中加入50μL反应混合液。反应混合液包含:

    并设两个空白对照,即分别没有DNA和没有引物。
    2) PCR扩增
    先95℃预变性5min,然后进行下列循环: 95℃变性30 sec,55℃退火30 sec,72℃延伸30 sec,40 个循环。最后,72℃延伸10min。
    3) PCR扩增产物的检测
    PCR 完毕后,取5μL 扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,电压为5 伏/cm,电解缓冲液为1×TAE(40mmol/L Tris-乙酸,1mmol/L EDTA),凝胶中含有0.05%的溴化乙锭,以PCR Markers作为分子量标记,在紫外透射仪上观察并照像记录。
    (二) 转基因植株的Southern检测
    转基因植株DNA提取同上,选用在SsNHX1基因序列中没有酶切位点的限制性内切酶BamH I进行酶切。杂交膜的制备、探针的制备和杂交过程等具体操作方法见《分子克隆实验》。

     << 上一页  [11] [12] 下一页

关于〖植物转基因技术〗的最新评论
昵称:      评分: 1分 2分 3分 4分 5分
内容:
生物秀实验频道
设为首页 | 加入收藏 | 关于我们 | 战略伙伴 | 友情链接 | 法律声明 | 广告服务 | 联系我们 | 网站地图
Copyright © 2003-2008 生物秀 (中国·生物秀科技) 版权所有 信产部备案:鲁ICP备05001831号
客服信箱:info@bbioo.com  客服电话:15800302289  客服QQ:254857951
www.bbioo.com All Rights Reserved.