② 在上述沉淀中加入20μ 连接反应液，溶解DNA。
③ 加入20μl 40% PEG#6000，均匀混合。
④ 加入1μl T4 RNA Ligase，16℃过夜反应（15-18h）。
⑤ 连接反应结束后，将连接液用TE Buffer 稀释10 倍，-20℃保存备用。
(4) PCR 反应
① 1st PCR 反应
a. 反应体系：
b．按以下条件进行反应：PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行25 个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min ，55℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。
② 2nd PCR 反应
a．反应体系：
b．按以下条件进行PCR 反应：PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：94 ℃ 变性1 min，60℃退火1min，72 ℃ 延伸1 min；循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。
c．反应结束后，取 PCR 反应液（5-10μl）进行琼脂糖凝胶电泳。
(5) 将2nd PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳片段克隆到pMD-18T 载体，进行鉴定和序列分析（方法同实验六、实验七）。
(6) 获得cDNA 5’末端序列后，将其与cDNA 的核心片断及3’末端序进行拼接。这就获得了cDNA的全序列。
