制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:①防止和抑制DNase对DNA的降解;尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
【操作】
一、材料处理
（一）新鲜或冰冻组织处理
1．取组织块0.3～0.5cm3，剪碎加TE 0.5ml,转移到匀浆器中制成匀浆。
2．将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
3．加20% SDS 25μl, 蛋白酶K(2mg/ml)25μl,混匀。
4．60℃水浴1～3h。
（二）培养细胞处理
1．将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次。
2．离心4000g×5min,去除上清液。
3．加10倍体积的裂解缓冲液。
4．在50～55℃水浴1～2h。
二、DNA提取
1．加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min。
2．离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3．加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。
4．加等体积酚/氯仿，轻轻混匀,离心5000g×1Omin,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。
5．加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。
6．加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。
7．待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液。
8．沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min,弃上清液。
9．室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50～100μl TE溶解过夜。
三、DNA定量和电泳检测
1．DNA定量 DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280m处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230m处。因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径,用H20稀释DNA样品n倍并以H20为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。OD260/OD280的比值应在0.4～0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在。
2. 电泳检测 取1μg基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。
