有色物质的显色，是由于它对光线的吸收具有选择性。白光是波长在400-750nm的电磁波，它是由各种波长不同，颜色不同；如果溶液对某些波长的光吸收较少而对其它波长的光吸收较多，则溶液呈现这种吸收较少而透过较多的光的颜色，例如溶液吸收了红光，透过蓝绿色光较多，则溶液呈现绿色。当然一些物质的最大吸收波长在可见光波长以外，如蛋白质的吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。当光线通过透明介质时,某波长的光有一部分被吸收,一部分透过,因此当光透射出溶液之后,光强度减少。Lambert-Beer定律是利用分光光度计进行比色分析的基本原理，这个定律是讨论有色溶液对单色光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度间的定量关系。
1． 朗伯（Lambert）定律：当单色光通过一吸收光的介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增长而呈指数减少，即
I/I0 = e-K1l
（ I0：入射光强度；Ｉ：出射光强度；l：介质的厚度）
2．比尔（Beer）定律：单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度增长而呈指数减少。即
I/I0 = e-K2C （C：溶液浓度）
两者结合在一起为朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。即
I/I0 = e-εCl
式中ε(L·mol-1·cm-1)系一常数,即消光系数，也叫摩尔吸光度；透光度T为I/I0，通常以百分率表示。
取对数 ： -lg T= -lg I/I0 = εCl = A
称为吸光度（A）。
采用适当的光源、棱镜和适当的光源接收器，让某一波长的光透过某一溶液，通过仪器的测定，定性鉴别物质或定量测定某一组分含量的方法即为分光光度法。通过光波长的调整，可使溶质浓度的测定范围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。经单色器（棱镜）得到的光源虽然不是纯的单色光，但波长范围更狭窄，更符合Lambert-Beer定律，其灵敏度大为提高。
3．计算
上式为实验操作中常用计算式。因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。
（2）标准曲线法： 先配制一系列已知不同浓度的测定物溶液,按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度，以各管吸光度为纵座标，各管溶液浓度为横座标，在方格座标纸上作图得标准曲线。以后进行测定时，就无需再作标准管，以测定管吸光度从标准曲线上可求得测定物的浓度。
一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围内为宜。所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行。尽管型号相同,操作条件完全一样，因不是同一台仪器，其结果会有一定误差。
