直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标（molecular beacon）就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而 不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团 脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列 直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。杂交探针（hybridization probe）使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素（donor），而下游的探针的5′端标记有受体荧光素（acceptor）。 在PCR中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移（FRET，此作 用与上述水解探针的方式相反），使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另 外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线（melting curve）对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。
1.3 定量方法 在real-time Q-PCR中，模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。
1.3.1 标准曲线的法的相对定量 由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中 样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA 或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH等）。
1.3.2 比较CT法的相对定量 比较CT法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT 值来反应起始模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏 移将影响实际拷贝数的估计。
1.3.3 标准曲线法的绝对定量 此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。质粒DNA和体外转入的RNA常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。
2 实时荧光定量PCR技术的应用
Ｒeal-time Q-PCR的应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性（SNPs）的测定等。以下就目前real-time Q-PCR在易位基因的检测，细胞因子的表达分析，肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测中的应用作一概述。
2.1 微小残留病变的检测 肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里 治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变（MRD）的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要 的。Real-time Q-PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白 血病（AML）最常见的染色体异常是交互易位t(8；21) (q 22；q22)，在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是白血病的病 因。目前的研究证明用real-time Q-PCR来检测融合基因有助于对这些病人的MRD进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因 水平，如慢性粒细胞性白血病（CML）的BCR-ABL融合基因；急性淋巴细胞性白血病（ALL）的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴瘤 （FL）的染色体易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的应用，随着技术的发展，Real-time Q-PCR的运用将不断地扩大。
