顾伟英 陈子兴 曹祥山 胡绍燕 朱江 王志林 严峰 王玮 岑建农 沈慧玲 钱军<BR>[摘要] 目的 探讨急性白血病患者骨髓中WT1的表达水平。 方法 建立实时定量RT-PCR方法，采用LightCycler PCR仪检测了108例急性白血病患者和23例非白血病患者骨髓中WT1及内参GAPDH的表达水平，以WT1<SUB>N</SUB> =（WT1拷贝数/GAPDH拷贝数）×10<SUP>4</SUP> 计算WT1表达水平。 结果 初诊与复发AL患者骨髓中WT1N的中位表达水平分别为75.10和89.56，明显高于CR组和对照组（分别为2.07和1.51），对照组与CR组之间及初诊与复发组之间无统计学差异；70例初诊急性白血病中ALL、M<SUB>1</SUB>、M<SUB>2</SUB>、M<SUB>3</SUB>亚型WT1N 表达水平明显高于M<SUB>5</SUB>，即粒系表达明显高于单核系，且WT1表达水平与外周血WBC计数、骨髓原始细胞比例、MDR<SUB>1</SUB>无相关性，但与染色体核型有关。对其中2例患者动态检测WT1可提示白血病复发。 结论 WT1在急性白血病患者骨髓中高表达，可作为白血病疗效考核及监测残留病灶的指标。<BR>[关键词] 白血病，急性； 基因，WT1； 逆转录聚合酶链反应<BR>Detection of WT1 expression in bone marrow of acute leukemia with real-time quantitative RT-PCR GU Weiying, CHEN Zixing, CAO Xiangshan, HU Shaoyan.The First Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu Institute of Hematology, Suzhou 215006, China<BR>[Abstract] Objective To investigate wilms’ tumor gene (WT1) expression levels in bone marrow(BM) of acute leukemia patients(Als). Methods Real-time quantitative retroverse polymerase chain reaction (RQ-RT-PCR) method was established for detecting WT1 and GAPDH expression levels in BM of 108 ALs and 23 non-leukemias by LightCycler. Normalized WT1 expression level (WT1N ) was determined as a ratio between WT1 and GAPDH times 10<SUP>4</SUP>. Results The Median expression levels of WT1N in 70 newly diagnosed ALs and 11 relapsed Als were statistically higher than those of 23 ALs with complete remission（CR） and 23 non-leukemic controls(75.10 and 89.56 vs 2.07 and 1.51 ). No statistic differences were found between the CR group and control group, nor between the newly diagnosed group and relapsed group. Of the 70 newly diagnosed Als ,Median WT1N expression level of acute granulocytic leukemias was significantly higher than that of acute monocytic leukemias （M<SUB>3</SUB>），but there were no statistic differences among the M<SUB>1 </SUB>, M<SUB>2 </SUB>, M<SUB>3</SUB> and ALL subtypes. Furthermore the WT1N levels were not correlated to WBC counts of peripheral blood, blast ratio of BM and multidrug resistant gene（MDR1） expression at presentation, but correlated to chromosome types.Dynamics of WT1N levels of 2 patients during treatment showed that WT1 expression levels could prognose relapse . Conclusion WT1 expression levels in ALs were strikingly higher than in non-leukemias who were undectable or lower expression. WT1 can be a marker for detecting MRD and evaluating therapy efficacy in leukemias.<BR>[key words] leukemia,acute; WT1; RT-PCR; real-time quantitative
WT1（Wilms’ tumor gene,WT1）定位于11p13，是最早发现与Wilms’肿瘤发生、发展有关的基因。 WT1主要在胚胎发生过程中表达，对泌尿生殖系统的发育起重要作用，在成人，WT1仅在肾脏、卵巢、子宫内膜、睾丸、脾脏、乳腺及正常造血祖细胞微量表达[1]。研究发现几乎所有的白血病原始细胞（无论系别）都持续过表达WT1，与其在极少数生理性造血干细胞（CD34+）中短暂低表达形成鲜明对比，定性和半定量RT-PCR法在区别单个核细胞WT1是生理性还是病理性表达存在缺陷和限制，WT1作为“泛白血病标志”（panleukemic marker）在急性白血病中的表达及预后意义是一个有争论的问题[2]，为进一步准确检测，我们采用实时定量RT-PCR技术检测了108例急性白血病患者骨髓中WT1的表达水平，报道如下：
对象与方法
1 研究对象 所有的白血病患者均来自苏州大学附一院及附三院血液科2002年3月~2003年10月门诊或住院治疗的患者，男62例，女46例，年龄6岁~72岁之间，中位年龄36 .5岁。白血病的诊断均经临床、血象、骨髓象及组织化学染色、免疫分型、染色体检查确诊，部份患者行融合基因检测，符合白血病MIC分型。其中AML 95例（M0 2例，M1 20例，M2 38 例，M3 18例， M4 7例， M5 10例 ），ALL 13例。对照组23例，为同期就诊非白血病患者（过敏性紫癜，缺铁性贫血 ，免疫性血小板减少性紫癜，巨幼细胞性贫血，淋巴瘤）及健康供者CD34细胞。以WT1高表达的K562细胞作为阳性对照。
2 主要试剂 TRIzol总RNA提取液购自Gibco BRL公司，逆转录酶M-MLV购自Promega公司，Taq DNA聚合酶购自上海申友公司。
3 骨髓单个核细胞分离：常规抽取患者骨髓液2~5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液（Ficoll分离液）分离单个核细胞，计数（5~10）×106细胞加TRIzol总RNA提取液1ml，混匀后-20℃冻存（时间小于2月）用于RNA制备。
4 RNA提取及定量：采用TRIzol一步法提取骨髓单个核细胞总RNA，紫外分光光度仪测定OD260，OD280吸光值（A），计算RNA含量。
5 cDNA链合成：逆转录反应体积为40ul，包括标本RNA 2ug，六随机引物100ng，5×逆转录buffer 5 ul, 10 mM dNTP 1.25 ul, Rnasin 25 U, 逆转录酶200 U。37℃ 45 min, 95℃ 5 min, -20℃保存备用。
6 定量阳性模板的克隆：培养K562细胞，在细胞生长的指数期收获细胞，同法提取RNA并逆转录成cDNA，Primer Premier软件设计引物（正义：5’-AGA GCG ATA ACC AC CAA CG- 3’；反义： 5’- GGC GTT TCT CAC TGG TCT CA -3’）扩增含WT1靶序的150bp的片段，纯化、测序后克隆至pMD18-T载体（上海申友公司），抽提、纯化重组质粒，测OD值，根据分子量及阿佛加德罗常数(6.023×1023分子数/mol)换算为分子拷贝数，按1011拷贝/ul浓度冻存于-20℃备用。GAPDH阳性模板由上海肿瘤研究所董强刚教授提供，以109拷贝/ul浓度存于-20℃备用。
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