（3）多肽和蛋白质DNS化氨基酸组成的溶液的制备
● 水解肽和蛋白质：取0.1ml 2m mol·L-1的多肽或蛋白质溶液，加入水解管中，再加优级纯盐酸，使盐酸浓度达到5.7mol·L-1，抽真空封口，置110℃水解16—20h（最好分别水解24,48,72h），水解完成后，开管转移到5ml烧杯内，置沸水浴中蒸去盐酸，干后加几滴蒸馏水，继续蒸干，反复数次除净盐酸。
● 水解氨基酸DNS化：加入0.1ml 0.2mol·L-1 NaHCO3和0.1ml DNS—Cl丙酮溶液，用1mol·L-1 NaOH调pH9—10，转移到具塞磨口试管中，置37℃保温1h，到此，肽和蛋白质DNS化的氨基酸组成的样品制备完成，即可点样展层。
此法与二硝基化苯相比的优点是，水解后无需提取水解产物，可用于电泳或层析法直接鉴定氨基酸，且灵敏度高。
2．以聚酰胺薄层层析鉴定DNS-氨基酸
（1）选择聚酰胺薄膜：聚酰胺薄膜有夹心式（即两面都涂有聚酰胺的板）和单面聚酰胺薄膜，单面的有4×4cm，7×7cm，5×15cm和7×11cm等几种规格。本实验选用4×4cm或7×7cm均可，并要求质地均匀，与尼龙板贴附牢固，无剥脱现象。
（2）点样：将粗细合适的毛细管用沙纸或砂轮将较齐的一头磨平，小心地将样品点在薄膜的右下角，距离边缘0.5cm的地方。样品点要求圆、小，不能把膜触破，最好一次点样成功，即在一处只点一下，因此样品的浓度要合适，如果浓度不够，则需重复在一处多次点样，即在第一次点样后，用吹风机吹干再点第二次、第三次等，在膜上标记。展层第一相样品在右下角，展层后彻底吹干，将膜顺时针转90°，即样品原点转到左下角展层第二相。
（3）展层
● 点样后在小的干燥器里进行展层，首先要在干燥器盖的边缘涂一薄层凡士林，使之密闭不漏气，放入培养皿并调水平。
● 向培养皿里加入展层剂，溶剂高度不超过3cm，盖上干燥器盖，使溶剂蒸汽在干燥器内达到饱和。
● 用皮筋或线将点好样的薄膜捆成半圆筒型，并能垂直放稳，皮筋不接触膜，膜在板的内面，即光面在外与皮筋接触。打开干燥器盖，将捆好的薄膜垂直放入盛有展层剂的培养皿里，立即盖好盖，溶剂即向上展层，当溶剂上升到离膜顶端0.5cm处时，停止展层，立即开盖标记前沿，取出，彻底吹干后顺时针旋转90°，以同样方法进行第Ⅱ相展层（用第（2）溶剂系统或根据需要可在溶剂系统（3）中展层）。
五、结果讨论：
绘制出层析图谱，并分析说明该蛋白质样品是由几条链组成？其末端—氨基酸是什么？其氨基酸组成如何？
六、注意事项：
1．制备的条件
在DNS-氨基酸制备时，DNS化必须在碱性条件下（pH9.7—10.5）进行，否则会有很多副产物DNS—NH2或DNS—OH产生。
测蛋白质或肽的N-末端氨基酸时，可用透析或Sephadex G-25，G-15，G-10层析，除去DNS-OH和DNS-NH2及小分子物质再水解。
2．封管水解的几个问题
（1）DNS化后，加5.7mol·L-1 HCl水解，一定要抽真空封管。否则110℃水解时易氧化破坏氨基酸。
（2）水解后一定要把HCl彻底除净。
3．点样展层
（1）点样：样品的点要小、圆、量要适当，否则拖尾，因此毛细管要细，头要平，样品浓度要合适，聚酰胺薄膜要选择优质的。
（2）展层要在小的、密闭的、底部水平的容器里进行，每次展层的温度、时间、展层剂的浓度要保持一致，否则不易重复。
4．鉴定未知样品的N-末端氨基酸
（1）内标法确定未知样品N-末端氨基酸：在一块薄膜上点未知的DNS-氨基酸，第二块膜上点已知标准DNS-氨基酸，第三块膜上将未知的和已知的同时点在一点上，展层后观察，如果在第三块膜的荧光加强并重合，表明此未知氨基酸同已知标准DNS-氨基酸一样，否则为不同的氨基酸。
（2）采用夹心型的聚酰胺薄膜，其膜的两面都涂有聚酰胺，可在一侧面点上待测的DNS-氨基酸；另一侧面点上对照的标准DNS-氨基酸。层析后可利用板的透明性质，比较、鉴定未知的DNS—氨基酸。
