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DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2006-9-1

    DNS—OH在紫外光下产生蓝色荧光,DNS—NH2的位点往往和丙氨酸重合,在本实验条件下,需进行第三相展层。
    根据鉴定方法需要,DNS—Cl的浓度5m mol·L-1(约每ml2.0mg丙酮溶液),保存在棕色瓶中,置避光处防止分解。样品浓度大约1m mol·L-1。反应液要求丙酮浓度50%,pH8.5—9.8,以保证游离氨基等功能团非质子化。在37℃保温,黄色消退即表示反应完全,一般约0.5h—1h。反应完后,混合物中含有较多DNS—OH,最好除去副产物后再水解DNS-蛋白质或肽。蒸干除去丙酮,加5.7mol·L-1 HCl,抽真空,封管在110℃水解20h,除去盐酸,加丙酮溶解点样展层,在紫外灯下鉴定荧光产物,同标准图谱比较,可区分未知DNS—氨基酸的种类。根据氨基酸的种类和数量可提供被测蛋白质或肽样品的纯度、肽链的数量和N-末端氨基酸的性质等方面的有价值的资料。

    聚酰胺薄层层析鉴定DNS—氨基酸。展层后可鉴定所有的DNS—氨基酸。聚酰胺是一类锦纶的化学纤维原料(或称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的叫作锦纶66:

    由己丙酰胺聚合而成的叫作锦纶6

    聚酰胺薄膜。
    聚酰胺薄膜的酰胺基团可与被分离物质之间形成氢键,因此对极性物质有很强的吸附作用(图19-3)。被分离物质与酰胺基团形成氢键能力的强弱,确定了吸附能力的差异。在层析过程中,展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键,选用适当的展层溶剂,使被分离的各种物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异经过吸附与解吸的展层过程,形成一个分离顺序,彼此分开。选择适当的溶剂系统在5×5cm大小的薄膜上双向层析,大部分氨基酸可有效地分开。

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