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DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2006-9-1

    DNS-蛋白质水解产物中包括下列DNS-衍生物:相当于N-末端的α-DNS-氨基酸,从链内赖氨酸及酪氨酸残基形成的ε-DNS-赖氨酸和O-DNS-酪氨酸,这些衍生物相当稳定。此外,DNS—Cl还与溶液中的氨起反应生成DNS—NH2,DNS-磺酰胺以及DNS—Cl水解生成的DNS—OH(DNS-磺酸)。
    此法与氟二硝基苯法相比,有二个突出的优点,即水解产物无需提取,可用电泳或层析法直接鉴定氨基酸;另外就是灵敏度高,DNS-氨基酸的最大荧光激发值约为550nm,由于其荧光十分强烈,1—5n mol·L-1或0.2—1.0n mol·L-1 DNS-衍生物即可分别用电泳或薄层层析容易地检测。
    DNS—Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物。其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可与DNS—Cl生成双DNS-氨基酸衍生物。这些氨基酸相当稳定,可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析,灵敏度达10—9—10—10摩尔水平。比茚三酮法高10倍以上,比过去常用的氟二硝基苯(FDNB)法高100倍。
    DNS-蛋白质(或肽),在5.7mol·L-1 HCl,110℃水解16—20h,DNS-蛋白质的肽键被打开。由于DNS基团与氨基之间的键结合牢固,绝大部分DNS-氨基酸都抗水解。除DNS-色氨酸全部被破坏;DNS-脯氨酸(77%),DNS-丝氨酸(35%),DNS-苏氨酸(30%),DNS-甘氨酸(18%),DNS-丙氨酸(7%)部分被破坏外,其余DNS-氨基酸很少破坏。
    DNS—Cl与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚反应,前两者在酸碱条件下均不稳定,酸水解时完全破坏;DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定,同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成,展层后在层析图谱的位点上,都与DNS-α-氨基酸有区别。
    DNS—Cl在pH过高时,水解产生副产物DNS-OH,即:

    在DNS—Cl过量时,会产生DNS—NH2,即:

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