2．蛋白质分子量测定
根据待测蛋白质的分子量范围选用Sephadex G-75或G-100型凝胶，其颗粒在40—120μm，柱管选用直径1.0—1.3cm，柱长90—100cm，本实验选用1.1×100cm商品层析柱。
（1）测定Vo和Vi
将0.5ml蓝色葡聚糖-2000和硫酸铵混合液（2mg·ml-1）上柱、洗脱，分别测出Ve。蓝色葡聚糖的Ve即为该柱的Vo，硫酸铵洗脱体积Ve减去Vo即为柱的Vi。蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵洗脱峰用Ba（Ac）2生成沉淀判断（若用重铬酸钾，其洗脱峰，可根据颜色判断）。
（2）标准曲线的制作
按上述方法将1ml标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液洗脱。流速3ml/10min，3ml/管。用部分收集器收集，核酸蛋白质检测仪280nm处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计280nm处测定每管光吸收值。以管号（或洗脱体积）为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。
根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。然后，以蛋白质分子量的对数1gMr为纵坐标，Ve为横坐标,作出标准曲线（图17-9）。为了结果可靠，应以同样条件重复1—2次，取Ve的平均值作图。同时根据已测出的Vo和Vi以及通过测量柱的直径和凝胶柱床高度，计算出的Vt，分别求出Kd和Kav。
也可以Kd或Kav为横坐标，1gMr为纵坐标作出标准曲线。
（3）未知样品分子量的测定
完全按照标准曲线的条件操作。
五、结果与讨论：
根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定1—2次，取其平均值，也可以计算出Kav，分别由标准曲线查得样品的分子量。
注 意 事 项
（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，以将用作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。 
（2）层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
用于脱盐的柱一般都是短而粗，柱长（L）/直径（D）＜10；对分级分离用的柱，L/D值可以比较大，对很难分离的组分可以达到L/D=100，一般选用内径为1cm，柱长100cm就够了。
（3）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
（4）装柱要均匀，不过松也不过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不宜过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。
（5）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。
（6）样品溶液的浓度和粘度要合适。浓度大，自然粘度增加。一个粘度很大的样品上柱后，样品分子因运动受限制，影响进出凝胶孔隙，洗脱峰形显得宽而矮，有些可分离的组分也因此重叠。
（7）洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。
