（2）装柱
装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气。装柱方法与一般柱层析法相似。层析柱可以自制或外购，目前已有各种规格层析柱商品（图17-6）。
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。接着再通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。
新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖，商品名为Blue dextran-2000）、红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg/ml的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。
（3）加样
要照顾到浓度与粘度两个方面。分析用量：1—2ml/100ml柱床容积（1—2%）；制备用量：20—30ml/100ml柱床容积。
加样方法与一般柱层析相同。夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约50cm处（Sephadex G-75，选用50cm液柱操作压），打开柱上端的塞子或螺丝帽，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。按加样操作，用1ml洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3—4ml洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图17-7）。
（4）洗脱
洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。洗脱用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水-甲醇、水—乙醇、水-丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组分洗下。本实验洗脱用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液。
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，以每管3ml/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。
影响洗脱液流速的因素有：
①洗脱液加在柱上的压力——操作压（由液面差引起）。一般来说，流速与柱压力差成正比，但对某些种类凝胶加压不能超过一个极限值，否则加大压力，不仅不能增加流速，反而使流速急剧下降，特别是在使用交联度小（WR＞7.5）的凝胶时要特别注意。为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。 
②凝胶交联度；交联度大的凝胶（G-10至G-50型）的流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。交联度小的凝胶（G-75 至G-200型）的流速与柱的直径有关，并在一定操作压差下有最大的流速值，操作压见图17-8。
③凝胶颗粒大小：颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。要求在不影响分离效果情况下，尽可能使流速不致太慢，以免用时过长。
（5）重装
一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用3—4倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需竟混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。
（6）凝胶的保存方法
凝胶用完后，可用以下方法保存。
①膨胀状态：即在水相中保存。可按注意事项（9），加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。
②半收缩状态：用完后用水洗净，然后再用60%—70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。
③干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60—80℃干燥后保存。这3种方法中，以干燥状态保存为最好。
