四、操作步骤：
1．样品处理：取20毫克酵母RNA，溶于2毫升0.3 mol·L-1氢氧化钾溶液中，于37℃水解20小时，RNA在碱作用下水解成单核苷酸，水解完成后，用2mol·L^-1过氯酸溶液高至pH2以下，以4000转/分离心10分钟，取上清液，用2mol·L^-1氢氧化钠溶液调至pH8，并用紫外分光光度计准确测得含量后待用。
2．离子交换柱的安装：取内径1.1—1.2厘米、高20厘米的玻璃管柱。下端橡皮塞中央插入一玻璃滴管供收集流出液，橡皮塞上盖以尼龙网和薄绢以防止离子交换树脂流出9见图14-2）。
将处理好的强碱型阴离子交换树脂悬浮液一次倒入玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下部，用一小片圆滤纸盖在树脂面上。缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上。（注意在整个操作过程中防止液面低于树脂，当液面低于树脂表面时空气将进入，在树脂柱内形成气泡，妨碍层析结果）。经沉积后离子交换树脂柱床高7—8厘米。
3．加样：将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤纸片内时，用50毫升蒸馏水淋洗树脂柱。碱基、核苷及其他不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗出。
4、核苷酸混合物的洗脱：收集蒸馏水洗脱液，在紫外分光光度计上测260nm处光密度，待洗脱液不含紫外吸收物质（光密度值低于0.020）时，可用甲酸及甲酸钠溶液进行洗脱。
依次用下列洗脱液分段洗脱，500毫升0.02mol·L^-1甲酸；500毫升0.15 mol·L^-1甲酸；500毫升0.01mol·L^-1甲酸-0.05mol·L^-1甲酸钠溶液（pH4.44）；最后用500毫升0.1mol·L^-1甲酸-0.1mol·L^-1甲酸钠溶液（pH3.74）。用部份收集器收集流出液，控制流速8毫升/10分，8毫升/管。
5、由层析柱所得各部分洗脱液的分析：以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液作为空白对照，用紫外光分光光度计测定各管溶液在260nm波长处光密度值，以洗脱液体积（或管数）为横坐标，光密度值为纵坐标作图，分析各部分的波峰位置（见图14-3）。
五、结果分析：
根据各部分核苷酸在不同波长时光密度的比值（O．D₂₅₀/O．D₂₆₀、O．D₂₈₀/O．D₂₆₀、O．D₂₉₀/O．D₂₆₀），对照标准比值（见表14-1）以及洗脱时相对位置，确定其为何种核苷酸。由洗脱液的体积和它们在紫外部分的光密度值，计算各种核苷酸的含量（各种核苷酸的摩尔消光系数见表5-1）。

表14-1  部分核苷酸的物理常数

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