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RNA的定量和完整性分析
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-8-31

    RNA 的完整性可以通过琼脂糖变性电泳分析检测,而含量则通过紫外分光光度计确定。常见的变性电泳有甲醛变性电泳,戊二醛变性电泳等。
    3.1 甲醛变性电泳检测RNA完整性
    一、材料、试剂和仪器
    1 材料: 植物总RNA 5-10μg
    2 试剂:
    1)加样运载缓冲液(Loading buffer)
    50% 甘油
    1mmol/L EDTA (pH 8.0)
    0.25%溴酚蓝
    25%二甲苯氰FF
    2)10×TAE Buffer
    3)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:
    0.1mol/L MOPs (pH7.0)
    40mmol/L乙酸钠
    5mmol/L DETA(pH8.0)
    4)甲醛, 甲酰胺
    3 仪器: 电泳装置,紫外透射观测仪
    二、实验程序
    1 甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制
    在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose (Sigama),再加20mL 10×TAE Buffer,144mLDEPC处理过的双蒸水,微波炉中化胶,待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛,放置一段时间以减少甲醛蒸汽。
    2 RNA的甲醛变性电泳
    1) 样品制备
    RNA总量10μg
    5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl
    甲醛 3.5μl
    甲酰胺10μl
    加入无菌离心管中混合,95℃水浴变性2min(或55℃,15min),取出后放入冰中冷却。
    2) 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度, 以确保DNA均匀进入样品孔内; 使样品呈现颜色, 便于加样操作; 能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置. 以 0.5 X TBE作电泳液时, 溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同 , 而二甲苯氰FF 的泳动速率与长 4kb 的双链线状DNA相同)
    3)将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中,点样前5V/cm预跑5min。点
    样后3-4V/cm电泳。
    4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8cm处),紫外灯下观察, 照相。
    3.2 RNA含量和纯度的测定
    一、材料,试剂和仪器
    1 材料: 待检测的RNA样品
    2 试剂: DEPC-H2O
    3 仪器: 紫外分析仪,石英比色杯

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