放射性核素因其灵敏度高而被人们利用在杂交筛选中，但它标记探针可利用时间短（放射性同位素有半衰期，如³²P为14.2天），并且对人体有害，易污染环境，所以近年来逐步发展了非放射性杂交筛选。按照标记方法的不同,主要有两类, 一种是预先已连在NTP 或dNTP上, 因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合反应方法参入到核酸探针上, 如生物素, 地高辛等, 由于生物素等标记物是连接在碱基上, 而不是磷酸基团, 因此不能用多核苷酸激酶进行末端标记。 另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上, 如生物素化学标记法的主要思路是: 将生物素与另一种化学性质较活泼的基团相连, 在特定的条件下是活泼基团活化而与核苷酸特定部位共价结合.
DIG（地高辛）、HRP（辣根过氧化物酶）及生物素等, 它们常通过显色，发光来显示杂交信号。本实验中就是通过连接臂共价连接在dUTP C¹¹上，如图13所示。DIG标记的dUTP代替部分dTTP掺入待标探针中，经杂交后用与碱性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）连接的DIG抗体发生免疫反应，通过Ap使反应底物CSPD脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同时释放出光子，可用X-光片显示杂交信号，如图14所示。

图14 Ap分解底物释放光子的反应过程

[1] [2] 下一页