Southern印迹杂交基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛细管作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做Southern DNA印记转移技术。烘干固定后即可用于杂交。

凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

Southern印迹杂交过程如图12所示。