有机附加物：肌醇 100
盐酸吡哆素 1
盐酸硫胺素 10
烟酸 1
激动素 0.2
萘乙酸 0.1
蔗糖 13700
木糖 250
(pH5.6 单位除注明的以外，其它均为mg/I)
通常我们将大量元素、微量元素和铁盐分别配置成10倍或100倍的母液，低温保存，在配培养基时，按比例吸取。
3．仪器
（1）大型仪器：
高压灭菌锅，超净工作台，离心机（4000rpm/s），倒置显微镜，振荡培养箱
（2）一般实验用品
细菌过滤器，滤膜，小滴管，小烧杯，大小培养皿，刻度离心管，小漏斗注射器10mL，小三角瓶50mL，不锈钢网300目，透气膜
四、实验方法
1．原生质体的分离
（1）将按上述配方配置好的培养基、洗液、需要灭菌的酶混合液及一般实验用品，用纸一一包好，0.1大气压灭菌20min。
（2）在超净台内将无菌烟草叶片从培养瓶内取出，放在培养皿内萎蔫1hr。如直接取室外培养的植物叶片，需进行表面灭菌，70%乙醇浸泡5s，无菌无水冲洗2次，再以2%次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲选3~4遍。
（3）在灭过菌的酶混合液中加入纤维素酶、果胶酶，待溶解后放入离心管内，3500rpms离心10min，弃沉淀留上清夜为酶混合液。
（4）在超净台内，用注射器抽取酶混合液，转入细菌过滤器（用无菌镊子夹取0。45um滤膜装入），向下缓缓压夜过滤，收集于小三解瓶中，封透气膜待用。
（5）把萎蔫（或灭菌）的烟草叶片至培养皿中，用小解部镊子撕下表皮及去叶脉，将叶片剪成0.5cm2的小块（不易太小，否则会得到过多地破碎细胞），浸在酶混合液中，封透气膜。黑暗振荡培养，保持27℃，酶解12-24hr，振速为50~60rpm/min.
2．原生质体的收集与纯化
（1） 取出装有酶解好材料的三角瓶，重新置于超净台内，将酶解物用小漏斗（加入300目不锈钢网）过滤，不锈钢网目的大小视分离的原生质体大小而异。过滤液收集于10mL刻度离心管中，500rpm离心2min，未消化完的细胞团或组织留在下锈钢网上面。去掉酶液，留沉淀即收集的原生质体。
（2） 用洗液和培养基将酶混合液洗干净，以免在以后培养时残留的酶液会影响原生质体壁的再生。用lmL洗液加到沉淀中，轻轻摇动，用力不可太大，以免原生质体破裂，500rpm离心2min，弃上清液，留沉淀，并重复1次。再用1mL，培养液将沉淀以轻打起，500rpm离心2min，弃上清液留沉淀。以上几步离心均在超净台内操作。
3．原生质体的培养
（1）用2mL培养液将沉淀轻轻悬起倒入2个小培养皿内，只需一薄层即可。用封口膜封口，以防污染和培养基中水份散失赞成渗透压提高，对原生质体是一种冲击，以至对其完整性的破坏。
（2）将小培养皿放在一装有湿滤纸的塑料袋中，要求在散射的暗淡光（强光刺激会使原生物质体致死）和湿润环境培养，温度25℃。第二天用倒置显微镜观察原生质体生长情况，视野内呈现出很大而圆的原生质体。2~3天后细胞壁再生，可用照相记录每天观察的结果。
（3） 原生质体密度：除在极少数富营养培养基中原生质体可以单个培养，并进一步分裂外，它其它培养基中培养原生质体必须有一定密度，不然难以分裂。密度参数值是104~105个/mL，确切的密度应该随材料、培养期其它条件不同而异。
（4） 原生质体再生
具有活力的原生质体在合适的培养条件下，3~6天就可以看见原生质体的第一次分裂，2周左右可见到小细胞团。要不断加入新鲜细胞培养基，加入的时间和容量按实验的情况而异，原则上要在原生质体一次或几次分裂后逐步再加入。
细胞团继续长大成愈伤组织到植株分化的过程与其它组织培养的情况相同。
