胶体核酸回收法
1. 仪器用具:
a. 桌上型离心机
b. 干浴器
2. 药品及试剂:
QIAqiuck gel extraction kit (Qiagen)或其它厂牌。
3. 方法步骤:
1)质体DNA经限制酶切割后,以含EtBr之1% agarose gel进行电泳,电泳后以长波长UV灯观察DNA片段所在位置,并以干净刀片将之切下,尽可能切越小越好。
2)取一微量离心管,秤重后再将切下的胶体置于管内再秤重,以估计胶体重,每管胶体不超过400 mg,加入3倍体积之QG buffer (即每100 mg胶体加入300 ml QG buffer 。
3)置入50 干浴器(内放水)水浴10分钟,期间可每隔2~3分钟以手指轻弹管壁以加速胶体完全溶解。
4)加入胶体一倍体积之异丙醇混合均匀,此时溶液为黄色(为原本QG buffer的颜色)。
5)将QIAquick spin column置于2 ml离心管中,加入上一步的gel solution,12,000 rpm 离心一分钟。(此spin column之最大容量为800 ml,若样品体积超过800 ml,则需分次加入)。
6)离心后,倒掉离心管流出液,将spin column置回原离心管中,加入750 ml PE buffer,静置5分钟。
7)13,000 rpm离心1分钟,到掉流出液,将spin column置于原离心管中,重复13,000 rpm离心1分钟。
8)将spin column置于另一个干净的1.5 ml离心管中,加入10~15ml EB buffer或水到silica membrane上,静置1分钟。
9)13,000 rpm离心1分钟,丢弃spin column,此溶液即为浓缩DNA供下一个定量或接合反应(ligation)。
DNA之定量及纯度测定
1. 仪器用具:
a. UV/VIS spectrophotometer (紫外线/可见光分光光度计)
b. UV灯箱
c. 拍立得(polaroid)相机或数字影像分析系统
2. 材料:
小量制备DNA质体、DNA片段、PCR产物或oligonucleotide
3. Spectrophotometer定量法:
测定260nm吸光值,OD=1.0代表值如下:
a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml
b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml
c. oligonucleotide = 33 mg/ml
4. Ethidium bromide定量法:
利用一系列不同浓度的DNA标准溶液(0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml),或已知浓度的DNA marker,和未知浓度DNA样品一起进行琼胶(洋菜胶)电泳,以EtBr染色后,于UV灯箱上照相,比较标准浓度及未知浓度的亮度,来求取DNA 的含量。
5. 测定DNA纯度:
测定样品在260 nm及280 nm吸光值之比较,由数值大小判定DNA的纯度。OD260/OD280=1.8表示DNA的纯度高,若数值<<1.8,表示纯度低,故单由OD260测得的DNA含量较不可信。

