α-32P cDNA探针标记：
（1）取模板DNA 25ng在离心管中。变性，冰浴。
（2）dNTPmix制备：dGTP、dATP、dTTP等量混合。
（3）将下列反应成份混合，加入上述离心管中： dNTPmix 2.0μl、 BSA 1.0μl、 5×Buffer 5.0μl、 Klenow 酶1.0μl、 α-32P-dCTP 2.5μl。
加入双蒸水适量，使反应总体积达25μl，轻轻混匀。室温下反应1小时。
预杂交：
常用的封闭物：
（1）变性的非特异性DNA：鲑鱼精子DNA；小牛胸腺DNA
（2）高分子化合物：Denhardt‘s溶液（含葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白等）。
杂交：
（1）离子强度：6×SSC
（2）DNA探针长度
（3）温度：低于Tm（熔解温度）15-25℃
（4）时间：16小时
洗膜
压片
膜的重复使用
（三）原位杂交：
原理：含有互补顺序的标记DNA或RNA片段（探针），在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。
应用：观察目的基因或mRNA 在细胞中的定位；半定量分析其含量变化。
直接法：用放射性同位素、荧光素、酶标记的探针与细胞内靶核苷酸形成杂交体，通过放射自显影、荧光显微镜或成色的酶促反应直接显示结果
间接法：用半抗原标记探针，最后采用免疫组织化学法对半抗原定位，间接显示探针与靶核苷酸形成的杂交体。
方法：
1、玻片：
洗→酸处理→冲洗→烤→粘附剂
常用的粘附剂：多聚赖氨酸、明胶、3-氨丙基三乙氧硅烷（APES）。
原位杂交专用玻片。
2、取材、固定：
（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。
3、组织切片的处理：
（1）脱蜡：石蜡影响探针的穿透性。
（2）去污剂处理：增加组织通透性。
（3）蛋白酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核苷酸探针的杂交能力。
（4）酸酐和酸处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景。
（5）杂交缓冲液孵育：阻断载玻片或组织标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，以降低背景。
（6）内源性生物素和酶的抑制：防止假阳性。
4、杂交：
（1）探针长度：以50-300bp为宜。
（2）探针变性：95℃，5-10分钟。
（3）探针浓度：
放射性同位素: 0.5ng/μl;
非放射性同位素2ng/μl。
（4）杂交温度：应低于杂交体融解温度（melting temperature， Tm）20-30℃。
（5）杂交时间：18-24小时。
5、杂交后处理：
去除未参予杂交体形成的过剩的探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，以降低背景。
6、对照试验
阳性、阴性、组织对照。
