3.3实验步骤
3.3.1 沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA
（1）在Eppendorf管中加入110ml的STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml）溶液，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。
（2）上述菌体悬浮液沸水煮20秒。
（3）迅速放置于常温下15 000rpm离心15分钟。
（4）用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100ml的异丙醇（注意不同样品管中的溶液平衡），充分混匀后15 000rpm离心15分钟。
（5）弃上清液，沿管壁四周加入70%冰乙醇400ml洗涤上述所得DNA样品，完毕后弃上清，管子倒扣10S左右，然后将DNA沉淀凉干。
（6）沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解，样品可取5ml酶切电泳分析或待用。
3.3.2 碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA
（1）取1.5ml过夜细菌培养液于1.5ml离心管中，于台式高速离心机中以15 000rpm，常温离心30秒，弃去上清液并将离心管倒扣在滤纸上。（4管/组)
（2）在离心管中加入100ml溶液I悬浮菌体，涡旋振荡，以充分悬浮菌体成均匀悬浮液。
（3）加入200ml溶液II，扣上离心管盖，立即轻轻混匀（来回颠倒数次），至溶液几乎澄清，成淡黄色透明粘液状。
（4）打开离心管盖，加入150ml溶液III，轻轻混匀（来回颠倒数次），看到淡黄色消失，有大量白色沉淀生成，然后离心。
（5）常温15 000rpm离心10分钟，小心吸取上清液于另一离心管中。注意，不要把白色絮状物混入上清液中。
（6）清液中加入等体积的苯酚饱和溶液：氯仿混合溶液（1:1）（各200ml），充分混匀，常温15 000rpm离心10分钟，小心将上清液转移至另一离心管。注意不要将下层有机相混入上清液中。
（7）在上清液中加入-20℃冷冻的异丙醇600ml，充分混匀，常温15 000 rpm离心10分钟。
（8）小心倾去上清液，注意避免把离心管底的白色DNA沉淀也随同上清倒掉。加入400ml 75%的冰乙醇，再15000rpm离心1min，倾去上清，倒扣离心管于滤纸上，稍许凉干。
（9）加入100ml无菌重蒸水溶解质粒DNA，可在37℃保温5~10分钟。(100ml/管，4管)
（10）合并于一管，加入2ml RNase，37℃保温30分钟，取5ml电泳检查消化彻底否。（以电泳前端无RNA条带为准）
（11）RNase消化完全后加入等体积的苯酚饱和溶液：氯仿混合溶液（1:1）（各300ml），充分混匀，4℃，15 000rpm离心15分钟，将上清液转移至另一离心管。
（12）在上清液中加入0.1倍溶液体积的3M, pH5.5 KAc（约40ml），400ml的–20℃冷冻的异丙醇，充分混匀，4℃，15 000 rpm离心20分钟。
（13）用400ml 75%的冰乙醇洗涤一次，再15000rpm离心1min，倾去上清，倒扣离心管于滤纸上，稍许凉干，待用。
（14）如需定量或检测制备的质粒DNA的质量，可取适量质粒DNA进行适当稀释，测定OD260nm和OD280nm值，计算OD260nm/OD280nm的比值。质粒双链DNA量可以1 OD260nm＝50mg/ml计算。OD260nm/OD280nm应为1.8左右。
3.3.3 沸水浴制备染色体DNA
（1）在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。
（2）上述菌体悬浮液沸水煮20秒。
（3）迅速放置于常温下15 000rpm离心10分钟。
（4）用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），上清待用。
3.3.4 大肠杆菌中染色体DNA的抽提
（1）大肠杆菌一级瓶培养过夜，以10%的接种量接二级瓶培养4～5小时后，培养物以50ml/管离心收获（8 000 rpm，5min，4℃）。
（2）菌体沉淀中加入10ml BufferA，旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。
（3）取出后加入10% SDS至最终浓度为1%，轻轻混匀，37℃保温30分钟澄清即可。
（4）取出后加入20mg/ml的ProK至最终浓度为5mg/ml，60℃保温1小时。（染色体DNA结合蛋白的消化）
（5）取出后加入预冷的5M NaCl至最终浓度为1M，混匀后冰浴30分钟（溶液要混合成为均相，并且冰浴要充分，时间可适当延长）。
（6）取出后4℃，15 000 rpm离心30分钟。（离心前样品管要进行平衡，以免离心机受损）
（7）在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液，混匀，室温下12,000rpm离心30分钟。
（8）在上清液中加入10ml氯仿，混匀，室温下12 000rpm离心30分钟。
（9）取上清液，加一倍量异丙醇沉淀DNA，冰浴放置30分钟，15 000rpm离心30分钟。
（10）75% 冰乙醇洗涤5分钟。
（11）晾干后，用300ml无菌双蒸水溶解染色体DNA，在37℃水浴中放置30分钟。
（12）用2～2.5体积的无水乙醇沉淀(加入pH5.5的KAc 0.1体积)。
（13）沉淀洗涤，抽干后用ddH2O溶解，分装并保存于-20℃。
