不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同,不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。目前针对不同类型的细胞均开发除了相应的抽提试剂盒。
常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时,一般所用的DNA量较少,可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。在短时间的热脉冲下,细胞膜表面会出现一些孔洞,此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来,然后离心去除菌体碎片,上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。而对于大量的基因组DNA制备(如Southern Blotting,需大量基因组),可采用试剂盒抽提。
3.2 试剂与器材
1. 试剂
(1)溶液I 碱溶法抽提质粒DNA
葡萄糖 50mM
Tris-HCl 50mM
EDTA 10mM
溶菌酶 5mg/mg 使用前加入
(2)溶液II 碱溶法抽提质粒DNA
NaOH 0.2M
SDS 1.0% 使用前用母液配制
(3)溶液III(pH5.5 3M KAc) 碱溶法抽提质粒DNA
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
(4)苯酚饱和溶液
苯酚溶解后用10mM Tris(pH8.0)平衡至上清中的水相pH升至8.0
(5)氯仿
(6)异丙醇
(7)STET溶液 沸水浴抽提质粒DNA
蔗糖 8%
TritonX-100 5%
Tris-HCl (PH8.0) 50mM
EDTA (PH8.0) 50mM 使用前加入溶菌酶至终浓度0.5 mg/ml
(8)Buffer A 大肠杆菌染色体DNA的制备
Tris-HCl (pH8.0) 10mM
EDTA (pH8.0) 20mM 使用前加入溶菌酶至终浓度5 mg/ml
(9)SDS(10%)
(10)NaOH(2M)
(11)NaCl(5M)
(12)RNaseA(10mg/ml)
固体粉末溶于无菌水后煮沸10分钟,后冷却并分装于小管中-20℃保存
(13)冰乙醇(70%) 可用95%乙醇配制,-20℃保存备用
2. 器材
(1)eppendorf管,枪头
(2)移液器
(3)水浴锅
(4)离心机
(5)摇床
3. 菌种
(1)E.coli JM83 F’,ara, D(lac-proAB),rpsL,(Strr),F80 DlacZDM15
(2)pMD-phoA/JM83

