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DNA的制备
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-8-29

    不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同,不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。目前针对不同类型的细胞均开发除了相应的抽提试剂盒。
    常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时,一般所用的DNA量较少,可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。在短时间的热脉冲下,细胞膜表面会出现一些孔洞,此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来,然后离心去除菌体碎片,上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。而对于大量的基因组DNA制备(如Southern Blotting,需大量基因组),可采用试剂盒抽提。
    3.2 试剂与器材
    1. 试剂           
    (1)溶液I                                        碱溶法抽提质粒DNA 
     葡萄糖                      50mM
    Tris-HCl                    50mM
    EDTA                        10mM
    溶菌酶                      5mg/mg             使用前加入
    (2)溶液II                                       碱溶法抽提质粒DNA
    NaOH                        0.2M 
     SDS                           1.0%                 使用前用母液配制
    (3)溶液III(pH5.5  3M KAc)   碱溶法抽提质粒DNA
    5mol/L乙酸钾            60ml
    冰乙酸                       11.5ml
    (4)苯酚饱和溶液
    苯酚溶解后用10mM Tris(pH8.0)平衡至上清中的水相pH升至8.0
    (5)氯仿
    (6)异丙醇
    (7)STET溶液                                沸水浴抽提质粒DNA
    蔗糖                          8%
    TritonX-100               5%
    Tris-HCl (PH8.0)        50mM
    EDTA (PH8.0)            50mM          使用前加入溶菌酶至终浓度0.5 mg/ml
    (8)Buffer A                                   大肠杆菌染色体DNA的制备
    Tris-HCl (pH8.0)         10mM
    EDTA (pH8.0)            20mM           使用前加入溶菌酶至终浓度5 mg/ml
    (9)SDS(10%)
    (10)NaOH(2M)
    (11)NaCl(5M)
    (12)RNaseA(10mg/ml)                
    固体粉末溶于无菌水后煮沸10分钟,后冷却并分装于小管中-20℃保存
    (13)冰乙醇(70%)                      可用95%乙醇配制,-20℃保存备用
    2. 器材           
    (1)eppendorf管,枪头
    (2)移液器
    (3)水浴锅
    (4)离心机
    (5)摇床
    3. 菌种           
    (1)E.coli JM83    F’,ara, D(lac-proAB),rpsL,(Strr),F80 DlacZDM15
    (2)pMD-phoA/JM83

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