（3）反应时间 常规酶切反应时间为1.5小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长2～3小时，有时甚至可以过夜。一般来说，在DNA量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA时，可以考虑酶切过夜。另对特殊实验，如对基因组DNA进行部分酶切，则在酶量投入一定的前提下，减少反应时间降低对DNA切割的程度。
（4）加入酶量 在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。但实验中常常出现酶量加入过多酶切效果反差的现象，这主要是酶的储存液中含有50％的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10％时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10％，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star活性）。
（5）DNA纯度 在满足上述条件下影响酶切效果的主要因素是DNA的纯度，DNA样品中蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）的残留、高浓度的RNA等。另外DNA浓度过高也会导致酶切失败，一般DNA的质量浓度在1mg/ml体系中能取得好的酶切效果。当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大（如从15ml-->30ml），将杂质相对浓度稀释，这样不需多增加酶量就能取得较好的酶切效果
1.1.3.2酶切方式
酶切方式可分为部分酶切与完全酶切：
（1）部分酶切 指的是同一DNA片段上的位点有些被切开而另一些未被切开，此法主要用于基因的克隆。在某些基因内部可能有此酶的切点，用完全酶切进行克隆时难以得到完整基因。部分酶切实施方法：a）在不同的时间从同一个酶反应管中取样终止反应，利用时间控制酶切程度，该方法比较繁琐，不易掌握得恰到好处；b）固定酶切的反应温度和反应时间，控制酶的投入量，一般是在反应管中加入不等量稀释的酶，利用不同酶浓度控制酶切程度，该方法因易控制而被广泛应用。
（2）完全酶切 适用于除目的基因克隆以外的绝大多数DNA操作，例如载体的切割，酶切图谱的制作，基因的鉴定与DNA片段的分离等。
1.1.3.3双酶切的解决方法
在DNA重组实验中，经常会用双酶切（甚至是3个酶切鉴定）鉴定重组子或获得不同粘性末端的DNA片段，而在厂商提供的联合酶切缓冲液表中并不包括所有类型的酶，即使提供了“万能缓冲液”，有些酶的联合酶切也不一定能取得比较好的效果，这里介绍两种通用的解决方法：
（1）分步酶切法 对将进行的两种酶的酶切采用分步的方法，即先选择一个酶，采用此酶的最佳反应条件进行酶切，酶切完全的DNA进行沉淀后再溶解，然后选用第二个酶进行最佳反应。在酶切时，一般选择便宜的酶进行酶切沉淀，而后在进行第二个酶的酶切反应。此方法通用性较强，联合酶切也比较完全，但较耗时，而且DNA在沉淀时后有部分损失，要求开始时DNA的投入量要比较高。
（2） 同步酶切法 取两种酶的最佳缓冲液各50％加入到酶切反应体系中，并同时加入两种酶进行反应。特别是对不同厂商提供的酶进行联合酶切时，即可节约时间也可取得比较好的酶切效果。
1.1.3.4酶切反应设计
在进行酶切反应时，首先要确定需切割的DNA量，根据DNA 的量确定总反应体系和酶量（最多占1/10），一般体系如下：
一般较好的酶切体系DNA的投入量不高于1.5mg/50ml，当DNA的投入量为1.5mg/20ml时酶切将发生困难。加样顺序：水-->缓冲液-->DNA-->酶。各组分加完后要混合均匀，并用离心机低转速将溶液离心至管底。
1.1.3.4酶切失败的原因及处理办法
酶切失败主要表现为两方面：
（1） 不完全酶切甚至是DNA基本未发生酶切；主要原因有：a）缓冲体系不合适，可进行重新酶切；b）酶量加入过多而导致甘油抑制酶活，可将反应体系适当稀释；c）DNA样品杂质含量高，可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切
（2） DNA被降解（不成带状）；主要原因是DNA样品中含有痕量的DNA酶，建议重新抽提除去DNA酶。
1.2试剂与器材
1. 试剂 （1）常用的限制性内切酶
（2）酶切缓冲液，购酶时附
（3）无菌双蒸水
（4）DNA样品
2. 器材 （1）eppendorf管
（2）枪头
（3）恒温水浴
（4）移液器
1.3实验步骤
