1.1.2.3甲基化影响
大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
1.1.2.4近末端切割
基因工程的操作中经常要对DNA片段进行精细切割，在PCR产物中有些甚至只切割一个碱基对。不同的内切酶对裸露的酶切位点不能切断，因此必需在酶切位点外侧加上一个或几个保护碱基，表1-2中列举了常用的十五种内切酶在不同保护碱基下的切割效果，一般保护碱基大于三个碱基对时能完全切割。但是在有些PCR产物中即使保护碱基大于五时也不一定能被有效切断，这可能是PCR产物纯化中残留的杂质影响酶切或是PCR产物末端聚合不完整。

表1-2 DNA末端酶切位点的切断情况

-：不能切断；±不能完全切断；+：完全切断

1.1.3限制性核酸内切酶的使用
限制性核酸内切酶在基因工程属常用工具酶，主要用于基因物理图谱的绘制、基因片段的鉴定或获得、用于杂交的DNA探针的制备等，而酶切的条件控制则是非常重要的。
1.1.3.1作用条件
在DNA的酶切反应中酶切条件是酶切成功的关键，主要影响因素有：
（1）反应温度  常规酶切反应均在37℃进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30℃，故最好根据所选用的酶确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切（见1.1.3.3）。
（2）缓冲体系  厂商提供的限制性核酸内切酶有其相对应的缓冲液，一般的缓冲液种类为4-10种左右，按盐离子浓度可分为三大类：高盐、中盐和低盐。缓冲液配制为10×的母液，酶切时稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表（宝生物工程公司）选择缓冲液或采用万能缓冲液（Promega）。

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