一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定
人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚、氯仿抽提,经RNase处理和纯化来提取DNA,可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验,在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定,除此之外,提取纯化的DNA还可用于分析其结构,序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法:
(1)取单层细胞,经无钙、镁PBS洗一次,用0.25%胰蛋白酶消化,细胞悬液经PBS洗2次,弃上清,取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL,pH8.0,0.1mol/L EDTA,10mmol/L NaCL,1%SDS)充分混匀,加入蛋白酶K至终浓度为0.5~1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%,混匀裂解蛋白呈糊状。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L,37℃水浴消化1小时,消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%,混匀,50℃水浴2小时,加入Nace至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次,步骤同前。
(12)吸上清,加入氯仿/异戊醇(24:1),按上法再抽一次。
(13)取水相,加入2倍体积预冷无水乙醇,-20℃ 1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次,真空干燥10分钟后溶于少量TE中,4℃贮存。
(二)DNA纯度检测及含量计算
DNA浓度用紫外分光光度计测定,核酸的光吸收值位于波长260nm处,蛋白质则位于280nm,分别测定后,其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值,说明DNA中仍残留较多的蛋白质,此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏,断裂严重,已成为小分子,因此操作应轻柔。
取少许DNA溶液,经紫外线扫描,吸收峰值位于波长260nm处,其纯度应为OD260/OD280=1.8
OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA,故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。
DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)
DNA分子量大小测定,可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定,根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小,此技术还可用作分离基因组DNA,进一步进行Southern吸印分析。

