温小杰 张桂寅 王省芬 李喜焕 马峙英
河北农业大学农学院, 保定, 071001
通信作者, mzhy @mail1hebau1edu1cn
摘要
棉花组织富含多糖、棉酚等次生代谢物质, 较难提取高质量的RNA。本研究在前人方法的基础上对快速提取棉花组织总RNA 的方法进行了探讨。利用改进的CTAB 异硫氰酸胍裂解缓冲液, 获得的RNA完整性好, 无DNA 污染, 含量高, 每克鲜组织能提取015mg 总RNA , OD260/ OD280比值均在117～210之间。该方法不但适用于叶片提取总RNA , 而且在根、花冠、种子、发育的纤维中均能提取出高质量的RNA , 同时节约成本, 相对于试剂盒提取RNA , 成本大为降低。
关键词
棉花组织, RNA , 提取
A Method of Total RNA Isolation in Cotton Tissues
Wen Xiaojie Zhang Guiyin Wang Xingfen Li Xihuan Ma Zhiying
Agricultural University of Hebei , Baoding , 071001
Corresponding author , mzhy @mail1hebau1edu1cn
ABSTRACT
The cotton tissues contain a lot of secondary metabolites such as phenolics , polysaccharides etc , thereforef rom which it is difficult to isolate high quality RNA.According to the prior research , a highly efficient ext raction method was modified1 High2concent ration and DNA2f ree RNA could be attained by using CTAB/ Guanidine Thiocyanate ext racion buffer1The total RNA can reach 1.7～2.0 of the OD260/ OD280 ratio with the yield of more than 015mg per gram of f resh tissues1 The method is suitable for high2quailty total RNA ext raction in leaves , root s , corollas , seeds and developing fibers. And the cost of this method is much lower compared with that using the commercicol kit of RNA ext raction.
KEYWORDS
Cotton tissues , RNA , Isolation
棉花组织RNA 的提取是进行棉花分子生物学研究的必要前提。进行Northern 杂交分析、体外翻译、建立cDNA 文库、RT2PCR 及差异显示分析等研究都需要高质量的RNA (李宏和王新力,1999 ; 赵双宜等, 2002) 。棉花组织中富含多糖、多酚等次生代谢物质, 在提取过程中, 多糖易与分子植物育种,2004 年,第2 卷,第1 期,第147 —150 页Molecular Plant Breeding ,2004 ,Vol12 ,No11 ,147 —150 RNA 共沉淀, 多酚类物质极易被氧化成红褐色物质, 然后与核酸不可逆的结合, 对RNA 的提取造成干扰。RNA 极易受到RNA 酶的影响而降解以及受到蛋白质、DNA 等的污染而降低RNA 的质量(Woodhead et al1 , 1997 ; Maliyakal , 1992 ) 。目前用于RNA 提取的试剂盒虽然操作简便、能快速提取植物组织RNA , 但其价格昂贵, 提取成本较高。本试验针对一些主要影响因素, 对快速简便提取棉花组织RNA 的方法进行了探索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料: 棉花品种为河北农业大学棉花育种研究室培育的“农大94 - 7”, 试验所用叶片、根、纤维、花冠、种子均取自新鲜组织。
1.1.2 试验药品: 异硫氰酸胍( Guanidine Thio-cyanate) 、丙烷磺酸(Moropholino ethanesulfonic acid ,MOPS) 、焦碳酸乙酯(Diethyl Pyrocarbonate , DEPC) 、β- 巯基乙醇(β- Mercaptoethanol) 购自Amresco 公司, 溴代十六烷基三甲烷(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide , CTAB) 、聚乙烯吡咯烷酮(PolywinyPyrro-lidone40 , PVP40) 、三羟基甲烷( TRIS) 、乙二胺四乙酸(Ethylenediamine teraacetic acid , EDTA) 等均购自Sigma 公司, 为超纯进口试剂, 其它试剂为一般分析纯化学试剂。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制:
RNA 提取缓冲液: 4Mol·L - 1异硫氰酸胍, 0.1Mol·L - 1 Tris 碱(pH815) , 114 Mol·L - 1NaCl , 0.02Mol·L - 1 EDTA , 2 %CTAB , 2 %PVP40 , 1 %β- 巯基乙醇。
MOPs 缓冲液( 10 ×) : 0.4 Mol ·L - 1 MOPs(pH710) , 0.1 Mol·L - 1NaAc , 0.1 Mol·L - 1EDTA 。上样染料: 50 %甘油, 1 Mol ·L - 1 EDTA ,0.4 %溴酚蓝, 0.4 %二甲苯青。
其它试剂: 均需用DEPC 处理过的水配制,经高温灭菌待用, 或为新开封专门用于提取RNA的试剂。所用试剂瓶、电泳槽也需是无RNA 酶污染的, 一次性使用的塑料制品如枪头、离心管等可经高温灭菌后直接使用。
1.2.2 提取步骤
取1g 左右的棉花新鲜组织加入液氮迅速研磨成均匀的粉末, 转入10mL 离心管中, 加入3mL预冷的RNA 提取缓冲液混匀, 置于冰上; 每管依次加入3 Mol·L - 1 NaAc200μL , 酸酚3mL , 氯仿:异戊醇600μL ( 每加一种试剂都要轻摇混合均匀) , 冰浴15min ; 4 ℃条件下, 5 300rpm 离心30min , 吸上清于另一离心管中, 加入等体积氯仿: 异戊醇混匀; 4 ℃条件下, 5 300rpm 离心20min , 吸上清加入等体积的异丙醇混匀后置于-20 ℃冰箱冷冻1h 以上; 4 ℃条件下, 5 300rpm 离心30min , 去上清, 用70 %乙醇清洗2～3 次, 并转入115mL 离心管中, 干燥后溶于适量DEPC 水中, 取1μL 进行检测, 其余- 70 ℃冰箱中保存。
