二、方法步骤
1．试剂的配制
（1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。
（2）烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA
（3）烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA
（4）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
（5）羧苄青霉素（cb）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
（6）链霉素（Sm）母液：100mg/ml，过滤除菌，－20℃保存。
（7）X－gluc（5―溴―4―氯―3―吲哚―β―葡萄糖醛酸）溶液（1ml）：称取0.5mg X－gluc，加入1～2滴N，N－二甲酰胺（DMFA）使之完全溶解，再加入980μl磷酸缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）、10μl铁氰化钾（5mmol/L）、10μl亚铁氰化钾（5mmol/L），搅拌混匀后加入1μl Triton X - 100、X－gluc溶液应现用现配。
2．农杆菌培养
（1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含100mg/L Sm和50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。
（2）活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。
（3）5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2MS液体培养基悬浮至OD600=0.2～0.5，准备感染用。
3．外植体的侵染及共培养
（1）取烟草无菌叶片，切成4～6mm的叶盘（或用打孔器制取），叶盘外植体浸入农杆菌菌液中，感染10min～20min，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。
（2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d。
4．选择培养
将共培养的外植体转移到含500mg/L Cb和100mg/L Kan分化培养基上，25℃，光照培养。
5．继代培养：每隔2～3周继代一次，并逐渐降低Cb的浓度至200mg/L。
6．生根培养：待培养筛选的抗性芽长至1～1.5cm时，切下并转入含有200mg/L Cb和75mg/L Kan的生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。
7．转基因植株的Gus基因检测
（1）从具有卡那霉素抗性的烟草植株上，剪取幼嫩叶片，放入0.25ml的小离心管中，加入适量的X－gluc溶液，叶片全部浸泡在染液中，盖好盖子防止挥发。
（2）37℃保温，染色2h可看到蓝色，染色过夜。
（3）依次用70%、80%、90%和100%的乙醇脱色，直至绿色褪去。
（4）观察转基因植株叶片与未转化植株叶片的颜色。
