注意定容！配好后用1.5ml 管分装！-70度保存
注意 这两个溶液 配的时候 比如配 50ml 用100ml的烧杯 用量筒量50ml 水 倒如烧杯里面，用记号笔标上刻度，然后把水倒掉，再称 尿素 小量加水，因为尿素加水后体积会变大，再37 度水域锅里溶，然后加其它成分，最后再定到50ml
(2002-10-30 18:39:37)
UKS液 (含9.5M Urea, 5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)
25ml 50ml
Urea 14.25g 28.5g
K2CO3 17.25mg 34.5mg
SDS 0.3125g 0.625g
DTT 0.125g 0.25g
2-ME
Ampholine(3.5~10) 1.25ml 2.5ml
Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 枪，4枪)
2-ME 可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存！
双向电泳IPG（summer）
一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法
（1） 在液氮中研磨叶片
（2） 加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。
（3） 加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后
真空干燥沉淀，备用。
（4） 上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上
1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5） 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
二、一向电泳（13cm的holder）
（1） 取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl
（2） 将上述溶液加到holder 的两个电极之间。
（3） 去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，
并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
（4） 在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
（5） 将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
（6） 设置仪器的运行参数：
三、胶条的平衡（由一向到二向）
（1） 将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（2） 将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分
钟。
（3） 用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳
（1） 将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.
（2） 设置仪器的运行参数：
五、平板胶的染色
硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）
（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。
（2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。
（3） 清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
（4） 银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。
（5） 显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去离子水。
（6） 终止：5%的醋酸。
（7） 照相分析。
（8） 保存制作干胶。
药品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。
平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87％的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。
