2.3.1.3 电泳后的凝条处理
电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱 想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器 枪头 玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段，各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。漫漫挤,管子,200 卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200 卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来, 注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿！还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF 胶条一样的,带,可能先在12%的TCA 里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了。不过在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿。
注意到下级液 磷酸 部分的胶条没，是不是有一节约2cm左右，比较突出，没有膨大的部分呀！只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢，大约3cm左右，呵呵!
对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2 次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成第一次的用 。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。
2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
选用DYY-Ⅲ型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为200×200×1mm），分离胶浓度为12%，无浓缩胶。待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。61厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2 边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE 电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，最后用水封胶。over！
做之前，一定要保证，1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE 胶，为一平的线，凹来凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化剂最好不过了。防止从边上漏，我用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2％的琼脂封。灌好电极缓冲液[25m mol/LTris，192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%硫代硫酸钠1min；水洗3×20s；0.2%硝酸银，0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停显。染色理想温度：我去年4,5月时,通常染色都定在中午,12点多;温度最好是20 度左右,(这个温度我也没控制的)100%TCA领一瓶TCA 500g的那种 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:
100%TCA 10ml
2-ME 0.07ml
丙酮 90ml
0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:
2-ME 0.07ml
丙酮 100ml
0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)
50ml
Urea 28.5g
NP-40 1ml
Ampholine 5~7 2.0ml
3.5~10 0.5ml
2-ME 2.5ml
