本法用含EDTA的溶液洗涤细胞,SDS(十二烷基硫酸钠)破碎、裂解细胞,消化蛋白质,使核蛋白解聚并使细胞内的DNA酶失活,用酚、氯仿变性蛋白质并去除杂质,最后用乙醇沉淀得到纯化的DNA。
[试剂]
1. 裂解缓冲液
2.苯酚-氯仿溶液
3.氯仿-异戊醇溶液
4.冰无水乙醇及70%乙醇
5.TE缓冲液
6.5mol/L NaCl
[操作]
1.处死小白鼠一只,取新鲜肝脏,用生理盐水清洗去血水。
2.每克组织加10ml裂解液制成匀浆。
3.取2ml匀浆于离心管中,加等体积苯酚-氯仿溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,
离心2500rpm×10min。
4.取上层水相,加等体积氯仿-异戊醇溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,离心
2500rpm×10min。
5.取上层水相至玻璃管内,加5mol/L NaCl至终浓度为0.3mol/L(2ml+100ul,3ml+150ul)。
6.加2.5倍体积的冰无水乙醇,加盖,缓慢摇匀,见白色絮状沉淀DNA出现。
7.用玻棒捞起DNA沉淀置于试管中,用1mLTE溶解。
8.定量
吸取DNA溶液100ul+2.9mlTE(30倍稀释),在260nm和280nm下读
取吸光度值,
9.计算
DNA浓度(ug/ml)=A260nm×50×1/光径×稀释倍数


