李惠芳 万远廉 刘玉村 汤坚强 吴 涛 张 英
朱 平 北京大学第一医院，100034)
摘 要：目的 分析直肠癌肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltating lymphocyres，TIL)克隆的TCRβ基因谱型及CDR3区氨基酸序列，了解直肠癌TIL抗肿瘤细胞克隆的基因特征。方法 采用RT-PCR方法扩增直肠癌肿瘤组织、术前外周血和术后外周血T淋巴细胞TCRβ基因的24个不同V基因片段，经过特殊的测序凝胶分离和银染色后，确定它们的TCRβ基因表达谱型。通过对PCR产物直接测序的方法，分析克隆性增殖的特征和CDR3区氨基酸序列。结果 直肠癌肿瘤组织TIL的TCRβ基因谱型中具有克隆性表达，表明直肠癌TIL是呈寡克隆性增生的淋巴细胞；来自2例不同患者的肿瘤组织中单克隆性表达的TCRβV11基因具有安全相同的DNA和氨基酸序列；其余四个寡克隆的CDR3区存在共同保守的氨基酸序列G／xGGN／xY（D)EQ。这些序列可能直接接触直肠癌肿瘤组织相关抗原。结论 直肠癌肿瘤组织TIL细胞中存在特异性识别肿瘤相关抗原肽的T淋巴细胞克隆。
关键词： 直肠癌；TIL；TCRβ；基因
中图分类号：R394．34 文献标识码： A 文章编号：1006-9534(2003)06-0014-05
The Characteristics of TCR repertoire in tumor—infiltrating lymphocytes from rectal cancer。Li Huifang，Wan Yuanlian, et al. (The First Hospital of Beijing University，100034)
Abstract：Objective：To study the antitumor clonal characterastics of tumor—infiltrating lymphocytes (TIL) in rectal cancer tissue, TCRβ gene repertoire and CDR3 amino acid sequence in TIL from the patients with rectal cancer were analyzed. Method：The 24 TCRβ V gene from rectal cancer tissues, peripheral blood lymphocytes in pre-operation and post-operation were amplified by the method of combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT—PCR) with denaturation polyacry1amide sequencing gel electrophoresis, Which is called TCRβ gene repertoire. In order to analyze the clonality of the over-expressing bands and CDR3 sequence，the PCR reproduction was sequenced directly．Result：TCRβ gene repertoire in TIL of rectal cancer tissues was clonallv expressed；The monoclonal expansion of TCR V11 from 2 different TIL had the same DNA sequence and amino acid sequence. The CDR3 in the rest of 4 oligoclones had a same conservative amino acid motif G／xGGN／xY（D)EQ．Conclusion：The clonal expanded cells in the TIL are supposed to be the peptide-specific anti-tumor T lymphocyte．
Key words：Rectal cancer；TIL；TCR β; Gene
近年来，人们越来越认识到肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL)在抗肿瘤中的重要作用。这些TIL细胞是可能与肿瘤相关抗原特异性的激活T淋巴细胞有关[1]。TIL是从肿瘤组织中分离得到的，对肿瘤细胞有一定的杀伤活性，目前还不能确定那一个T细胞克隆具有抗肿瘤特异性，对这群T淋巴细胞的生物学特征的了解也还十分有限。本研究是通过已经建立的确定T细胞受体 (T Cell Receptor，TCR) 基因谱型的方法[2]，分析直肠癌中侵浸润性淋巴细胞TCR β基因谱型及CDR3区氨基酸序列，试图了解直肠癌肿瘤组织TIL抗肿瘤细胞克隆的分子特征。
资料与方法
1．病例选择和标本的采集。2002年北大医院住院的直肠癌肿瘤患者6例；术后肿瘤组织的病理诊断均为直肠腺癌，采集标本前的6个月内无化疗药物以及与免疫有关的药物史。5例男性，1例女性，年龄在45 ~ 81岁；于术前抽取患者静脉血10ml；留取肿瘤组织标本约1cm3；术后第10一14d第二次抽取静脉血10ml。抽取健康成人静脉血10ml作对照。
2．提取静脉血单个核细胞和组织的总RNA。在抽取静脉血后立即采用TRIzol (GibcoBRL公司) 试剂盒提取单个核细胞总RNA。取约100mg的肿瘤组织，生理盐水漂洗三遍，经研磨后用同样方法提取细胞总RNA。
