实验目的
    提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。 
 
实验原理
    碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 
 
实验材料和试剂
    （一）实验材料
     大肠杆菌DH-5a（pUC118）（使用实验一转化平板上的菌）。
    （二）培养基和试剂
    1. LB液体培养基
       同实验一。
    2. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin, Amp），配制成100mg/ml备用。
    3. 溶液I ： 
           50mmol/L   葡萄糖
           25mmol/L   Tris-HCl（pH8.0）
           10mmol/L   EDTA（pH8.0）
            2mg/ml     溶菌酶
     4. 溶液II ： 
           200mmol/L  NaOH
           1%         SDS
    5. 溶液III ：
            3mol/L     NaAc（pH4.8）溶液
    6. TE缓冲液 ：
            10mmol/L   Tris-HCl（pH8.0）
             1mmol/L   EDTA
    7. 预冷的无水乙醇
    （三）器材
    接种针                      1ml移液管                                               
    1.5ml Eppendorf管            200ml吸头                   
    冰块                        牛皮纸
    纱布盖                      线绳
    （四）仪器
    微量移液器                  涡流混合器
    低温高速离心机 
 
实验步骤
    1．取100mg/ml的氨苄青霉素20ml 加入到20ml LB液体培养基（20ml/250ml三角瓶）中，使氨苄青霉素的含量为100mg/ml，分装到5×150mm试管中，每管3ml。分别挑取实验一转化平板上的单菌落，接种到含有100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基（3ml/试管）中（每组挑2个菌落）。37℃振荡培养过夜（约16小时）。
    自下一步骤起不需无菌操作
    2．取1ml菌液于1.5ml Eppendorf管中，3000r/min离心5分钟，弃去上清液，湿菌体在涡流混合器上振荡均匀。
    3．加入100ml溶液I，摇匀。冰浴10分钟。
    4．加入200ml溶液II，温和振荡，溶液变粘稠，而且清亮透明，冰浴10分钟。
    5．加入150ml溶液III，温和振荡，出现白色沉淀，冰浴10分钟。
    6．4℃ 10,000r/min离心10分钟，将上清液小心倒入另一个新Eppendorf管中，加入800ml预冷的无水乙醇。-20℃冰箱中放置1小时，沉淀DNA。
    7．4℃ 10,000r/min离心10分钟，弃去上清液，将Eppendorf管中所有液体挥发干净。
    8．加入20ml TE缓冲液溶解DNA。 

[1] [2] 下一页