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各种组织特殊染色法—病毒包涵体染色法
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-8-9

    6.浸染于上述稀释液,在室温中染12-24小时。
    7.用正丁醇分化切片,于镜下控制至合适为止。
    8.正丁醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
    结果:海蓝组织细胞胞浆可见到充满海蓝色小空泡,有的可见到海蓝色子颗粒。
    注意事项:
    1.配Giemsa浸染液时,可根据不同的病毒包涵体来配制。如染胞浆内的包涵体,PH可用5.0,7.6,如果染核内的病毒包涵体PH可用7.6或9.5,即可获得满意的结果。
    2.应用柠檬酸分化切片时,浓度应特别低,如果浓度较高,很容易将着染的颜色除去,因为浸染液的浓度很稀。
    3.切片进入丙酮脱水时,可将着染的紫色除去,留下绿色,因而切片的最后结果有绿色的显示。
    4.切片在丙酮脱水后进入下一步丙酮和二甲苯时,直接进入,不要控干切片,切片如在空气中暴露过长时间,可吸收大量水分,导致切片不能透明。
    (三)伊红和甲基蓝显示合胞病毒和巨细胞病毒包涵体。
    1.切片脱蜡至水,蒸馏水洗。
    2.浸入PBS3次,3分钟/次。
    3.浸入伊红和甲基蓝浸染液中浸染过夜。
    4.0.01MPBS冲洗10-15分钟。
    5.0.01柠檬酸水溶液分化切片,镜下控制。
    6.风干,二甲苯透明,中性树胶封固。
    结果:合胞病毒和巨细胞病毒包涵体着染深蓝色或绿色。于细胞核内,胶原纤维着染浅蓝绿色。SARS病毒包涵体不着色。
    小结
    病毒非常微小,最小的约为20nm左右。因而用一般的光学显微镜是无法观察到它的,从病理技术的角度,也就无法对它们进行鉴定了。但是当它们进入机体,形成包涵体后,就可以根据它们的所在部位和形态,应用不同的特殊素对它们进行显示和确定。当然鉴定病毒主要还要靠电子显微镜和其它生化手段。如鉴定SARS病毒时,于电镜下可见部分扩张的滑面内池内有群集的,大小较一致的病毒颗粒,表面有细小的花冠状微粒,病毒颗粒大小约为70-90nm。上述所应用的几种不同的特殊染色方法,对已形成的几种病毒包涵体的显示,经反复实验证明,是比较好的方法。
    病毒属于一类非细胞结构,无自主繁殖能力的微生物,它必须依所侵蚀所寄宿的宿主细胞提供高分子合成装置和能量,它的基本结构是由核酸和蛋白质构成,当它们被融合在一起形成一小体后,方能在光学显微镜下被观察到,这些小体依其属性存在于细胞的不同部位,这些小体通常被称为病毒包涵体。
    病毒种类很多,由它侵蚀机体并形成包涵体的种类也有不同,经研究发现由两类物质所构成一类是由DNA所构成属于碱性,在HE染色过程时呈深蓝色,位于细胞核内,包涵体的四周为空白区,造成这种现象的主要原因是病毒为了保存自己而形成的,病毒包涵体形成需要四个阶段:一是侵入阶段,病毒通过吸附,穿入等手段进入细胞核,二是大量繁殖,复制并完全控制细胞核阶段,整个细胞核均匀一致的颗粒所覆盖;三是收缩防守,构筑堡垒的阶段,分散于整个细胞核中的病毒逐步收缩集中建立起自身的桥头堡,并将细胞核逐步挖空,此时细胞中的骨架被损坏,细胞逐步变形;四是包涵体完整成形阶段,此时细胞核中间有一独立的圆形小体,四周被挖空,跟细胞的其他部分没有联系,形如孤岛,由于它的构造特殊,与外界失去联系,因而治疗此类病毒的药物无法达到,导致药物治疗效果不佳。合胞病毒和巨细胞病毒等属于这一类病毒,它们由DNA构成,应用Macchiavello氏改良法显示其包涵体效果不好,应用Giemsa在PH7.6和9.5时效果好,应用伊红和甲基蓝显示效果也很不错。另一类病毒包涵体则由RNA所构成,呈嗜酸性,位于细胞浆中,在HE染色中包涵体呈淡粉红色,SARS病毒等属于这一类。它们的包涵体的形成也要经历几个阶段,即进入构筑堡垒和包涵体形成三个阶段。当它们以吸附等方式进入机体后,于细胞浆寄宿下来,为了不暴露自身和保护自己,除借用细胞中的装置复制病毒外,还分泌毒素,将周围的蛋白质融合,形成包涵体。至于为什么有的病毒进入细胞核有的病毒进入细胞浆的原因,目前尚不清楚。

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