过碘酸盐氧化法，酶的RZ值≥3时较佳；RZ<3时，糖含量较少，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量，据报告，适当地控制过碘酸盐溶液及反应条件，几乎所加入的HRP和抗体均形成酶标抗体，其标记率为70%左右。具体步骤为：
（1）4mg HRP(RZ=3.0)溶于1.0ml双蒸水中。
（2）加0.2ml新鲜配制的0.1mol/LNaIO4，轻轻摇动混合20min,肉眼可见液体内棕黄变成深绿色。
（3）对0.1mol/L醋酸盐缓冲液（pH4.4）透析，20h，4℃。
（4）调整HRP液体的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5),立即加入抗体(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸盐缓冲液溶解),轻轻混匀后,置室温2h。PH≤8.5时,抗体的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能与CHO基反应,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。
（5）加入0.1ml新鲜配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以稳定酶标抗体复合物。
（6）经透析等去除未反应的NaBH4 ，避免还原过度。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体（方法同戊二醛法）。
如此制得的酶标抗体，加入终浓度1%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）分装后于-80℃可保存数年；亦可加入6%等量甘油，混匀置-20℃/4℃保存1年左右。上述两种标记法是ICC研究中最常用的酶标抗体制备方法。
3．Maleinmide法 上述酶标抗体（IgG）的分子量较大，对抗体的穿透性有一定影响，而在制备过程中，需经两次纯化，即多聚体与单体及单体与非标记抗体的分离。已知单体（1个HRP分子标记1个IgG分子）的分子量为190～200kD，非标记抗体为146～150kD，用凝胶过滤法很难将二者分开。所以,Sternberger等进行了抗体片段Fab的标记。用植物性蛋白酶---木瓜酶（Papain）水解抗体蛋白，可获得一个无抗体活性稳定的Fc段结晶和两个相同的抗原结合片段（Fab），此Fab段为单价，分子量50kD,HRP标记后，单体分子量为90kD,较容易将单体和非标记的Fab段分离。在此基础上，Imagawa(1982)又进行了改良，引入了N-羟基丁二酰酯（Maleinmide），标记抗体的特定部位---Maleinmide法。该方法的主要原理是：（1）借助双功能试剂Maleinmide活化HRP，使其具有与—Hs 基反应的能力；（2）利用胃蛋白酶水解IgG，IgG重链在近羧基端被切断，这样在绞链区（Hinge region）至少可以保留一个S-S键，从而得到一个具有双价抗体活性的F（ab＇）2段。该S-S键与抗体活性无关。可以通过加入硫基乙醇（2（β）-Mercapto ethanol, HSCH2CH2OH）使其断裂，被还原成—HS基 。如此双价抗体活性的F（ab＇）2片段即变为带有—Hs 基的单价Fab’片段，后者再与活化的HRP结合，便制成了酶标抗体Fab＇。由于空间遮蔽的关系，绞链区即使存在两个—HS基，也只能有一个能与酶结合，另一个—HS基不能与酶反应，即酶与抗体Fab’段结合比例为1：1，因此酶标抗体Fab’段绝大多数是单体，很少形成多聚体。在标记过程中，应用过量的活化HRP，还能避免非标记抗体Fab＇段的存在。Fab＇段的分子量与Fab段相似（50kD左右），所以酶标后Fab＇亦较容易与未标记的Fab＇分离。此标记方法多用于酶免疫分析研究，其步骤为：
①6mg HRP溶于1.0ml PBS(pH7.0)中。
②4mg Maleinmide 溶于0.5ml N, N二甲基酰胺（N,N-dimethylformamide）中。
③将上述两种液体充分混合，持续搅拌1h,30℃。
④离心取上清，经0.1mol/l PB(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱层析，收集含有蛋白部分的洗脱液，浓缩，制得活化HRP。
⑤每1.8mg活化HRP，加入已被还原的Fab＇2mg,4℃20h持续搅拌。
⑥ Sephadex G-200/Sephacryl S-200分离酶标抗体Fab＇片段，保存同前。
（三）酶标抗体的纯化
上述各种方法制备酶标抗体时，除产生酶标抗体外，还有未标记的抗体蛋白、游离酶、酶二聚体及偶联剂等。这些均可使酶标抗体的敏感性下降，故酶标抗体须经纯化后应用。现简介几种常用的纯化方法。
1．多聚体的分离 实验中，不同的试剂形成的多聚体的数量各异，即使同样的实验药物和程序，在不同的时间制备的酶标抗体中，多聚体的数量亦不相同。多聚体较单体含酶量多，与组织的非特异吸附增强，使方法的敏感性下降，故用前必须除去多聚体。以凝胶过滤法分离多聚体的效果较好。
