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酶的性质实验—酶的特异性
作者:未知 来源:沈阳药科大学 时间:2006-8-8
    实验原理】
    酶的特异性是指酶对它所催化的反应以及底物结构有严格选择性,一种酶只对一种物质或一类结构相似的物质起作用。酶比一般催化剂特异性强,因酶是一种蛋白质,结构复杂,在其精细的空间构象中,存在一个特殊部分“活性部位”,能专一地与对应的底物结合,体现酶的特异性。
    本实验以蛋白酶和淀粉酶对相应底物蛋白质及淀粉的作用为例。来观察酶的特异性,实验结果的检查根据酪蛋白水解生成酪氨酸,酪氨酸与福林试剂呈蓝色反应,淀粉能与碘起蓝色或兰紫色反映来确定。

    【实验材料】
    1. 实验器材
    试管及试管架;移液管;烧杯;恒温水浴锅; 温度计
    2. 实验试剂
    ⑴ 1% 淀粉溶液:将1g淀粉溶解于100ml蒸馏水中。
    ⑵ 1%酪蛋白溶液: 称取酪蛋白1克于研钵中,先用少量蒸馏水湿润后,慢慢加入 0.2mol/L NaOH 4ml,充分研磨,用蒸馏水洗入100ml容量瓶中,放入水浴中煮沸15分钟,溶解后冷却,定容至100ml,保存于冰箱内。
    ⑶ 1/2000碱性蛋白酶溶液: 精确称取干酶粉2克,加入pH10硼砂氢氧化钠缓冲溶液10ml,在小烧杯中溶解,并用玻璃棒搅拌,静止片刻后,将上层液小心倾入容量瓶中,残渣部分再加入少量缓冲液,如此反复搅拌溶解4次,最后全部移入200ml容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度,充分摇匀,用二层纱布或四层纱布过滤,吸取滤液5ml,移入100ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,所得液为稀释2000倍的酶液。 
      ⑷ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液:
    甲液(0.05moL/L硼砂溶液):取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克,用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。 
        乙液:0.2moL/L氢氧化钠溶液。 
        配制pH10硼砂-氢氧化钠溶液:吸取甲液50ml,再加入乙液21ml,用蒸馏水定容至200ml。 
      ⑸ 0.4 mol/L碳酸钠溶液
      (6) 0.4 mol/L三氯醋酸溶液
    ⑺ 福林试剂: 在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2W04·2H20)、125g钼酸钠(Na2Mo04;2H20)、350ml蒸馏水、25ml 85%磷酸及50ml浓盐酸,充分混匀后回流10h。回流完毕,再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴,冷却后定容到500ml,过滤,置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。 
      ⑻ 1/2000淀粉酶溶液:用蒸馏水作稀释溶剂,配制方法同碱性蛋白酶液相同。
      ⑼ 碘-碘化钾溶液: 称取碘10克,碘化钾20克,同溶于100m1蒸馏水中,贮于棕色瓶内。使用前稀释10倍。
    【实验操作】
      1.取五支试管, 编号,按下表加入试剂:

                     

    试剂

    试管编号

    对照

    1

    2

    3

    4

    1% 酪蛋白溶液(ml)

    1.0

    1.0

    1.0

     

     

    pH10 缓冲液(ml)

     

    1.0

     

     

     

    蒸馏水 (ml)

    2.0

     

    1.0

    1.0

    1.0

    1% 淀粉溶液(ml)

     

     

     

    1.0

    1.0

    1/2000碱性蛋白酶溶液(ml)

     

    1.0

     

     

    1.0

    1/2000淀粉酶溶液(ml)

     

     

    1.0

    1.0

     

    2.将各管充分摇匀后,于40℃水浴中保温15分钟。
    3.于3、4号管中各加碘溶液2滴,观察实验现象,做好记录。
    4.于对照管及1、2号管各加入3.0mL 0.4M 三氯醋酸溶液,摇匀,分别过滤,各吸取滤液1.0ml,加0.4M碳酸钠溶液5.0ml,福林试剂1.0ml,摇匀,于40℃水浴保温15分钟。取出后观察三管的现象,并记录。
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