【实验目的】
掌握用考马斯亮蓝染料结合比色法测定蛋白质含量的原理和操作方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰变为595nm。蛋白质含量在1-1000μg范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
蛋白质-染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏度高，稳定性好，是一种测定蛋白质含量的常用方法。
【实验材料】
1.实验器材
721型分光光度计；试管；移液管；容量瓶。
2.实验试剂
(1)标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成100μg/ml的溶液。
(2)考马斯亮蓝G-250试剂：称取 100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95％乙醇中，加入85% (m/v) 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液可在常温下放置一个月。
(3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。
【实验方法】
1. 绘制标准曲线
取6支干燥洁净的大试管，编号，按下表加入试剂。
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管号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
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标准蛋白溶液（ml） 蒸馏水（ml） 考马斯亮蓝G-250试剂（ml） 蛋白质含量（μg） |
0.0 1.0 5 0 |
0.2 0.8 5 20 |
0.4 0.6 5 40 |
0.6 0.4 5 60 |
0.8 0.2 5 80 |
1.0 0.0 5 100 |
2. 样品测定
准确吸取1.0ml样品溶液于一支干燥洁净的试管中，加入考马斯亮蓝G-250试剂5ml，摇匀，室温静置2min， 以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。
【实验结果】
根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
【思考题】
1.试比较Folin-酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法的优缺点。
2.试比较二喹啉甲酸法与Folin-酚法的优缺点。
3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？
4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？
