【实验目的】
掌握用BCA方法测定蛋白质含量的原理和操作方法
【实验原理】
BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。
蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。
【实验材料】
1.实验器材
721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管架和试管。
2.实验试剂
(1) BCA试剂的配制
① 试剂A，1L：分别称取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。
② 试剂B，50ml：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸馏水至50ml。
③ BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。
(2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。
(3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。
【实验操作】
1.绘制标准曲线
取6支干燥洁净的大试管，编号，按下表加入试剂。
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管号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
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标准蛋白溶液（μl） 蒸馏水（μl） BCA试剂（ml） 蛋白质含量（μg） |
0 250 5 0 |
50 200 5 20 |
100 150 5 40 |
150 100 5 60 |
200 50 5 80 |
250 0 5 100 |
2.样品测定
准确吸取250μl样品溶液于一干燥洁净的试管中，加入BCA试剂5ml，摇匀，于37℃保温30min，冷却至室温后，以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。
【实验结果】
根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
