(9)PLP液(过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液)。
该固定剂适用于富含糖类的组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基,通过赖氨酸的双价氧基与醛基结合,从而与糖形成交联。组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成,抗原决定簇位于蛋白部分,故该固定液有选择性地使糖类固定,既稳定缺的,又不影响其在组织中的位置(固定剂7-9配制法见附录1)。
2.非醛类固定剂Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出,碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定,单独使用时,边缘固定效应重,但与戊二醛或多聚甲醛混合使用,效果明显改善。
(1)碳化二亚胺(1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI)液:2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于标记多肽类激素的组织,对标记IgA、IgG效果不佳。
(2)碳二亚胺-戊二醛液(ECD-G液):配制法见附录一。
ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide Hydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐,简称乙基-CDI。
该液常用于多肽类激素的固定,对酶等蛋白质固定效果良好,对细胞内抗原定位,超微结构保存好,是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究的良好固定剂。
(3)Zenker’s 液(重铬酸钾2.5g,氯化汞5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml,混合溶解后,临用时加水醋酸5ml)。
该固定液对免疫球蛋白染色最佳,固定时间约2-4h,染色前必须脱汞色素。
3.丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂,其作用是沉淀蛋白质和糖,对组织穿透性很强,保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,解决的办法是和其它试剂混合使用,如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
(1)Clarke氏改良剂(100%酒精95ml,冰醋酸5ml),用于冰冻切片的后固定。
(2)乙醚(或氯仿)与乙醇等量混合液。
Danos(1976)等认为其组织穿透性极强,即使涂片上富于过多的粘液,固定效果仍然良好,是理想的细胞固定液。
(3)AAF液:95%-100%酒精85ml,冰醋酸5ml,浓甲醛10ml。
(4)Carnoy氏液:100%酒精60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml,混合后4。C保存备用。
(5)Methacarn氏液:甲醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml,混合后4。C保存备用。
以上两种固定液适宜某些抗原,癌基因蛋白产物检测的 固定,P53抗癌基因蛋白产物,PC-NA等抗原的保存。
丙酮的组织穿透性和脱水性更强,常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定,保存抗原性较好,平时4。C低温保存备用,临用时,只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min,取出后自然干燥,贮存于低温冰箱备用。
以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液,用于免疫组化的固定剂种类很多(见附录),不同的抗原和标本需经过反复试验,选用最佳固定液。不少学者认为,迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织,免疫组化染色标记结果可截然不同,致使人们无所适从。选择最佳固定液标准是:①最好地保持细胞和组织的形态结构。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们,中性缓冲福尔马林(或多聚甲醛)是适应性较广泛的固定液,但固定时间不宜过长。必要时,可作多种固定液对比,从而选出理想的标准固定液。
固定组织时应注意:①应力求保持组织新鲜,勿使其干燥,尽快固定处理。②组织块不易过大过厚,必须小于2cm×1.5cm×0.3cm,尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量,在体积上一般大于组织20倍以上,否则组织中心固定不良影响效果。④组织固定后应充分水洗,去除固定液造成的人为假象。


