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免疫组化操作流程
作者:未知 来源:生物秀 时间:2006-8-6

    (一)、仪器设备
       1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;
        2)水浴锅 

    (二)、试剂 
        1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
        2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。
        3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
        4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 
        5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
        6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
        7)封裱剂:
        a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合; 
        b、油和TBS(或PBS)配制。  
        8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。 
    (三)、操作流程 
        1、脱蜡和水化 
        脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 
        1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;
        2)无水乙醇中浸泡5分钟;
        3)95%乙醇中浸泡5分钟; 
        4)70%乙醇中浸泡5分钟; 
        2、抗原修复
       用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
       1)抗原热修复
       (1)高压热修复 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
       (2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10~15分钟。
       (3)微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。 
       2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。

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