3  材料
3.1  菌种
大肠杆菌（Escherichia  coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
3.2  染色剂
结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。
3.3  仪器或其他用具
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。
4  流程
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
5  步骤
5.1  涂片
5.1.1  常规涂片法
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
5.1.2  “三区”涂片法
在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
5.2  初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
5.3  媒染
用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。
5.4  脱色
    用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
    革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。
5.5  复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
5.6  镜检
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
5.7  实验结束后处理
清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。
6  结果
6.1 根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
6.2列表简述两株细菌的染色结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。
7  思考
7.1 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
7.2 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
7.3 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?
7.4 不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？
7.5 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节?
7.6 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
7.7 如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?

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