(三)标准曲线的绘制
1．标准曲线的作用
(1)标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线，它是比色分析法中不可缺少的步骤。从浓度一 光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合Lamben-Beer氏定律。
(2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。
(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。
(4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。
2．标准曲线的作法
(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。
(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。
(3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。
①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ：2)，以横
轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。
在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。
②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。
③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。
④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。
⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。
⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。
(四)待测溶液浓度的计算：
(1)利用标准管法计算待测溶液的浓度：
在同样实验条件下同时测得标准管和待测管的吸光度值，然后进行计算：
根据Lambert-beer定律：
标准管：A=KCSL (下标S：标准液)
待测管：Ax＝KCxL (下标X：待测液)
在实际操作中，有时需要求待测液的含量，为计算简便，常使待测管体积与标准管体积相等（以X代表测定管含量，S代表标准管含量）则：
计算待测溶液浓度时，可根据测定时实际吸取的标准液的体积（VS）和待测样品的体积（VX），将上式演变为：
待测溶液浓度：
(2)利用标准曲线进行换算：
先配制一系列已知不同浓度的标准溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管光密度，以各管光密度为纵轴，各管浓度为横轴，在方格坐标纸上作图得标准曲线，以测定管光密度从标准曲线上可求得测定物的浓度。
(3)直接利用公式进行计算
如果已知摩尔消光系数k，则可直接利用公式进行计算求得物质的浓度。
由 A=KLC 推出
练习：分光光度法的应用——CuSO4含量测定
取中试管3支，按下步骤操作
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试剂 |
标准管 |
测定管 |
空白管 |
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CuSO4标准液（ml） |
1.0 |
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CuSO4测定液(ml) |
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0.8 |
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蒸馏水(ml) |
6.0 |
6.2 |
7.0 |
各管混匀，以空白管调零点，在700nm下比色，读取各管光密度值，据标准管法求待测CuSO4溶液的浓度（mg/ml）
