本实验以兔抗根瘤菌血清的制备为例说明。

　【材料】

　1•  菌种：艾特利根瘤菌（ Rhizobium etli ）。

　2•  动物： 2 -3kg 的健康雄家兔或未怀孕的雌家兔。

　3•  药品、试剂：生理盐水，完全福氏佐剂，1%硫柳汞。

　4•  器材：一次性注射器，碘酒酒精棉球， 1 0 × 100 试管， 100ml 血清瓶。

　【方法】

　1. 制备抗原：用 YMA 斜面培养艾特利根瘤菌 3 天 ， 用 0.5% 石炭酸生理盐水洗涤 3 次后制成悬液； 100 ℃ 水浴处理 1h ， 用麦氏比浊管将菌液浓度调至 10 9 个 /ml ，分别保存于 50ml 血清瓶备用，各加一滴 1% 硫柳汞防腐，于 4℃ 冰箱保存。

　2. 免疫兔子：以艾特利根瘤菌菌悬液为抗原按表 3.1 对兔子进行免疫。 

表 3.1 免疫日程表

　　取 2ml 抗原与 2ml 完全弗氏佐剂于小烧杯， 60℃ 水浴中充分混合（用无针头 1ml 一次性注射器来回抽吸）。取 1ml 抗原 - 佐剂混合物注射兔子后腿肌肉。两周后，不加佐剂对兔子进行静脉注射，抗原剂量为 1ml 。四周后，再对兔子进行一次静脉注射。

　3. 抗体效价测定：最后一次注射 7 天之后，对兔子进行耳缘静脉取血 5ml 。待血液凝固后吸出血清，即为一抗，保存于 10ml 血清瓶中。取 10 支血清管（ 10×100 试管），用生理盐水按图 3.1 对一抗进行稀释。另取 2 支相同试管作对照，编号为 11 和 12 ，取 2.5ml 生理盐水分别加入这 2 支试管中。在 1-11 号管中加入抗原 2.5ml ，在 12 管中加 2.5ml 生理盐水。将 12 支试管放入 60℃ 水浴中 1h 后，观察实验结果，出现絮状沉淀的最高稀释度即为抗体的效价。

图 3-1 抗体的稀释

　4. 心脏采血：当一抗效价达到 1/1600 时，开始大量采集抗体。用 20ml 注射器从兔子心脏采血 25ml ，放入 100ml 血清瓶中，待血清析出，用移液管转入另一血清瓶中，加 1 滴 1% 柳硫汞防腐，置 -20℃ 冰箱保存备用。

　【结果】

　　观察血清的量及颜色，并做好标记。

　【注意事项】

　1 ．免疫家兔时注意无菌操作，以防感染。

　2 ．分离血清时所用器皿要干燥、清洁以防溶血。

　【作业】

　1. 影响制备特异性强、效价高的抗血清的因素有哪些？

　2. 如何保存抗血清？