四 药品配制
1.溶液Ⅰ
50mmol／L 葡萄糖
25mmol／L Tris·CI(pH 8．0)
10mmol／L EDTA(pH 8．0)。
在101bf／in2(6．895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ（现用现配）
0.2mol／L NaOH
1％ SDS
3.溶液Ⅲ
5mol／L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
4.STET
0.1mol／L NaCL
10mmol／L Tris·Cl (pH8.0)
1mmol／l EDTA(pH8.0)
5％ TritonX一100
5.溶菌酶溶液
10mg／m1，用10mmo1／L Tris·C1(pH 8.0) 配制
6. LB 培养基：
胰蛋白胨 10g
酵母提取液 5g
NaCL 10g
溶于800ml水中，用NaOH调pH至7.5后，用水定 容1000ml。高压灭菌。
7. TE缓冲液：10mmol/L Tris pH 8.0； 1mmol/L EDTA
五 实验报告
1. 使用碱裂解法提取质粒DNA时，溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用是什么？加入后，又分别产生哪些现象？
2. 列举碱裂解法提取质粒DNA的哪些步骤 会影响DNA的产量和纯度？
1.取1-5ml菌液，10,000rpm（台式高速离心机）离心1分钟收集沉淀，尽量控尽培养液。
2.加250μl懒得溶液p1，震荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3.加250μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
温和地混合，不要剧烈震荡。此时菌液应变的清亮粘稠，所有时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变的清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4.加350μl溶液p3，温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12，000rpm离心10分钟，取上清。
5.将上一步得上清液加入吸附柱CB3种（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
6.可选步骤：加入500μl区蛋白液PD，12,000rpm离心30秒，弃废液。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂志，如对所提质粒纯度要求较高，可加此步骤；如下一步实验为PCR等对质粒纯度要求不高的实验，可略过此步骤。
7.加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
8.加入500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
9.间吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心3分钟，尽量去漂洗液。
10.取出吸附柱CB3，放入一个干净的离心管中，加50-100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液应事先在65-70摄氏度水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12,000rpm离心1分钟
