如动物仍表现四肢肌肉紧张或活动自如，必须重新毁髓。操作过程中应注意使蟾蜍头部向外侧（不要挤压耳后腺），防止耳后腺分泌物射入实验者眼内（如被射入，则需立即用生理盐水冲洗眼睛）。
2、坐骨神经—腓肠肌标本制备
（1）剥制后肢标本
如果动物个体较大，可将双毁髓的动物腹面向上放入蜡盘中。一手持手术镊轻轻提起耻骨联合上方的皮肤，另一手用手术剪横向剪开皮肤，再剪开体壁肌肉（开口要大）。
然后用手术镊轻轻提起内脏，自耻骨部剪断（勿损伤脊神经）。一手轻轻托起蟾蜍后肢，使头部及内脏向下，看清支配后肢的脊神经发出部位，于其前方用金冠剪横向剪断脊柱。
然后再沿脊柱两侧到横向切口剪断体壁，一手用蘸有任氏液的拇指和食指捏住断开的脊柱后端，另一只手向后撕剥皮肤并除去断开脊柱以上部位肢体及内脏。
如果下肢撕皮困难，可在撕皮至股部时，用手勾住双股中间后再行撕剥。将剥干净的后肢放入任氏液中备用。清洗手及用过的手术器械。
（2）分离两后肢
将去皮的后肢腹面向上置于蛙板上，脊柱端在左侧，用左手拇指和食指固定标本的股部两侧肌肉，右手持手术刀，于耻骨联合体处向下按压刀刃，切开耻骨联合。然后用手托起标本，用金冠剪剪开两后肢相连的肌肉组织，并纵向剪开脊柱（尾杆骨留在一侧），使两后肢完全分离。将分开的后肢，一只继续剥制标本，另一只放入任氏液中备用。
（3）分离坐骨神经
将一侧后肢的脊柱端腹面向上，耻端向外侧翻转，使其足底向上，用固定针将标本固定在蛙板上。用玻璃分针沿脊神经向后分离坐骨神经（图）。
