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SMART技术回顾
作者:未知 来源:dxy 时间:2006-1-8


    二、SMART cDNA Library Construction Kit

        常规的建库需要在合成的cDNA双链两端通过连接加上相同或者不同的adaptor,用相应的酶切后可以插入载体中。由于连接效率低往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失,使文库偏重高丰度和较短的基因,失去应有的代表性。在做表达文库时,如果cDNA的两端是同一个酶切位点,由于cDNA可能按两个不同的方向接入载体,反向接入载体的那些cDNA不能正确表达,因而有50%的可能丢失。然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶切是否完全的问题,影响产率。另外由于表达时3个碱基代表一个氨基酸,不同的表达框架会得到不同的产物,因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法,但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。

        利用SMART技术建库,可以得到全长的cDNA文库,也不需要Adaptor的连接。这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同,分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。SfiI是一个在真核生物基因组中极为稀少的酶,出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。SfiI识别序列为GGCCNNNN^NGGCC,中间的5个碱基为任意序列。因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切,得到的是两端的粘端不同的cDNA,这样就可以定向插入特定的载体中,不会浪费50%的信息。

        这个试剂盒提供的载体也很有特色:lambdaTriplex2载体有特别设计,可以用3个不同的表达框架分别同时表达一段插入的DNA。这样就保证插入的片断的正确的表达产物能被筛选出来而不会漏掉。

    三、SMART RACE cDNA Amplification Kit

        对于DD-PCR或者SSH、RNA指纹、EST芯片等方法得到DNA片断,要钓全长cDNA,或者用同源序列钓其他物种中的同源基因,3'端的扩增一般都不成问题,难就难在5'端的片断扩增。利用SMART技术将SMART引物自动加入cDNA的5'端,不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦,而且能得到全长的cDNA 5'端。只要少至25个碱基的已知序列即可钓出全长的cDNA。

    四、Altas SMART Probe Amplification Kit

        由于DNA芯片上的点多,每个点的样品量很有限,要足够的灵敏度需要有足够多的探针。当制备探针的样品来源有限时,这个试剂盒就是解决办法之一:利用SMART技术可以将少至1000个细胞来源的RNA制备得到足够的cDNA探针。得到的探针能代表mRNA原有的丰度,而且操作简单。

    五、即将推出的Super SMART PCR Kit能够从少到2ng的Total RNA中制备多达1微克的cDNA!而且制备的探针灵敏度提高10倍、稳定性较原有的试剂提高30%!详细信息请留意生物通快讯。

        总之,SMART技术是研究人员利用酶的天然属性,经巧妙设计而成为研究人员进行研究的有力武器。大自然还有更多的奥妙等待我们去发现。

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