（一）第一链合成
　　下面介绍的是25ml体积反应系统，该系统可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反应体积10ml，如5mg mRNA需55ml反应体积。
　　引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA的比例应分别保持为0.5mg/mg（对NotⅠ引物-延接头为0.3mg/mg）和15m/mg.
　　1、试剂：
　　[a-32P]dCTP（>400ci/mmol），EDTA(50mM和200mM)，TE饱和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE缓冲液(10mM Tris·Cl,pH8.0,1mm EDTA)。
　　2、操作步骤：
　　（1）取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管加入的RNA样品，及引物或引物-延接头，用H2O调节0.5mg引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接头/mg mRNA）的体积至15ml，70℃加热5分钟，待冷至室温，离心数秒钟使溶液集中在管底，然后依次加入：
　　　　5×第一链缓冲液 5ml
　　　　rRNasinR RNA酶抑制剂 25ml
　　　　40mM焦碳酸钠2.5ml
　　　　AMV反转录酶 15m/mg RNA
　　　　加无水RNA酶水至总体积25ml
　　在加入焦碳酸钠和AMV反转录酶前，需将反应液42℃温浴5分钟，以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。
　　（2）轻弹eppendorf管，取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其体积不能超过1ml），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
　　（3）42℃温浴1小时。
　　（4）取出置冰上。
　　（5）掺入测定的eppendorf管加入50mM EDTA，终止反应，并使总体积为100ml。可取90ml进行电泳分析，另10ml进行同位素掺入测定。
　　（6）第一链合成离心管可直接用于第二链合成。

　　（二）第二链合成
　　第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。