5、 cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟, 低速离心后置冰上。
6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃温浴10分钟。
7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。
8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。
9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分钟后离心5分钟。
10、 小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。
11、 小心移去上清液,干燥沉淀。
12、 沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。
（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析
1. 试剂
1mg/ml鲑鱼精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。
2. 操作步骤
(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。
(2) 同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。
(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性。
(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。
3. 第一链产量测定
第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%
掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)
设330为每mol dNTP的平均分子量
合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol
mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)×100%
例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则:
掺入率＝3040/254000×100%=1.2
掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。
4. 第二链产量计算
除需去除第一链掺入dNTP外,方法同第一链产量计算
第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??
掺入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率
第二链cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol
双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ng)/ 单链cDNA合成量(ng)
例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm.
第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%
第二链合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二链cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng
双链cDNA转变率=155ng /158ng×100%=98%
一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。
