5. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；
6. 各孔内依次加入50μl待测样液，每个样品3次重复，15～20℃，20min；
7. 加入50μlHRP标记激素，37℃，60min；
8. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；
9. 加入100μlOPD基质液，37℃显色15～20min，加入50μl 3mol/L H2SO4中止反应。用酶联免疫检测仪测定490nm下各孔的A490值，求出每份样品重复孔的平均值。
10. 用激素标准母液和参比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。
固相抗原型ELISA。
1. 用主阵法滴定选择各反应物最适工作浓度；
2. 将100μl“激素-蛋白”复合物溶液包被于微孔板，37℃，12h；
3. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；
4. 加入100μl0.1％封闭蛋白溶液封闭，37℃，30min；
5. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；
6. 各孔同时加入50μl样液和50μl抗激素Pab溶液，以加入正常兔血清溶液的孔（非特异吸附孔）为空白调零，37℃，60min；
7. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；
8. 加入100μlHRP-GARIG溶液，37℃，60min；
9. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；
10. 随后的显色、中止与比色程序同上；11.用激素标准参比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。
四、结果计算
固相抗体型ELISA。
1. 加入激素母液的的孔（非特异吸附孔）为空白调零，以加入不含激素的PBS的孔为B0孔，以加入激素标准参考系列溶液的各孔为Bi孔。以标准激素摩尔数的常用对数log［激素］为横坐标（X），对应的ln［Bi／（Bo-Bi）］为纵坐标（Y），可得一条Y＝a＋bX直线；
2. 将样品孔的A490值代入上式，换算出待测样品中激素摩尔数量，乘以稀释倍数，除以样品重量，即为每克样品的激素含量。
固相抗原型ELISA以加入不含激素的磷酸缓冲液的孔为Bo孔，以加入激素标准参考系列溶液的各孔为Bi孔。标准曲线计算与结果分析同上。
