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植物组织中DNA的提取与测定
作者:佚名 来源:本站原创 时间:2005-12-5


        10. 0.2mol/L NaOH。
        11. 二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml浓硫酸,装入棕色瓶,贮存暗处,使用时加0.1ml乙醛液[浓乙醛:H2O=1:50(V/V)]。
        12. 1.0mol/L 高酸溶液(HClO4)。
        13. 0./L 高氯酸溶液。
        14. 0.05mol/L NaOH。
        15. DNA标准液:取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中,再用0.05mol/L NaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中,加5.0ml 1mol/L HClO4,混合冷却后用0.5mol/L HClO4定容至刻度,则得100μg/ml 的标准溶液。

        三、实验步骤

        (一)DNA的提取与纯化:1. 称取去胚乳小麦芽10g(或其它植物幼嫩组织)剪碎置研钵中,加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。2. 将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,加上塞子,剧烈振荡0.5min,转入离心管,静置片刻以脱除组织蛋白质。接着以4000rpm离心5min。3. 离心后,形成三层,小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4. 将试管置72℃水浴中保温3min(不超过4min),以灭活组织的DNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加5mol/L 高氯酸钠溶液[提取液:高氯酸钠溶液=4:1(V/V)],使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5. 再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中,振荡1min,静置后在室温下离心(4000rpm)5min后,取上清液置小烧杯中。6. 用滴管吸95%的预冷乙醇,慢慢地加入烧杯中上清液的表面上,直至乙醇的体积为上清液的两倍,用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7. 将核酸沉淀物在烧杯内壁上轻轻挤压,以除去乙醇,先用5ml的0.1×SSC溶液溶解,然后加入0.5ml左右的10×SSC,使最终浓度为1×SSC。8. 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9. 加入已处理的Rnase溶液,使其最后的作用浓度为50~70μg/ml,并在37℃水浴中保温30min,以除去RNA。10. 加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白,在室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。11. 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。(若不做8~11步,得到的是粗制品)。

        (二)DNA的鉴定(紫外吸收法)核酸类物质含有嘌呤、嘧啶碱基,这些碱基中都有共轭双键(=C-C=),在紫外区260nm处有最高吸收峰,230nm处有最低吸收峰,纯化的DNA在UV-120紫外分光光度计测得有A260/A280≥2即为DNA的典型吸收峰。只要将第7步提出的DNA粗制品溶解并定容至5ml,即可上机测定。


     

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