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实时定量PCR技术检测乙型及丙型肝炎病毒
作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-12-3


    前言:
    感染性疾病的最大特点是存在病原体。病原的检测在感染病学的诊断中占有极其重要的地位。聚合酶链反应(Polymerase  Chain  reaction  PCR)是体外扩增特异性DNA或RNA片段的一种技术,通过PCR的扩增,样品中的靶DNA或RNA可以成千上万甚至百万倍的增加。上个世纪的90年代以前,乙型及丙型肝炎的实验室诊断仅依靠ELISA法检测抗原抗体。ELISA法的检测仅在ng水平,而PCR可以检测至fg水平。由于PCR技术原理简单,操作简便,曾一度在全国各地遍地开花,但由于没有统一标准,质量得不到控制,污染问题没有解决,曾被限制应用。近几年随着定量PCR的开展,上述问题已基本解决。卫生部临检中心已经举办了多次推广学习班,随着质控标准的实施,PCR技术将在临床诊断中广泛应用。
     
    PCR技术的理论依据:
    PCR技术的原理并不高深,但思路却很精巧而独特。PCR技术对分子生物学各个领域的发展起到了很大的推动作用,是80年代、90年代最重要的分子生物学技术之一。它的设计者由此获得了1993年生物医学的诺贝尔奖。
    二十世纪人类最伟大的两大发现是DNA双螺旋结构及计算机技术。PCR技术就是根据DNA复制的原理和DNA聚合酶作用的特点而设计的。DNA在高温的条件下变性,由双螺旋结构变为单链(变性denaturation);在一定温度下,引物(Primer)以碱基配对的方式与单链结合(退火,annealing);在合适的温度、Mg2+浓度及缓冲液中,在DNA聚合酶的作用下,使反应液体系中的dNTP按照5’-3’方向聚合(延伸,elongation),形成的新的DNA单链与模板单链的核苷酸序列互补(图1),经过这样一个循环,双链DNA得到加倍,反复进行,可以2n倍数增加。
     
    实时、定量荧光PCR技术原理:
    为了更精确的检测样品中DNA或RNA的含量,我科目前采用瑞氏罗氏公司的实时、定量、全自动PCR检测仪。图2、图3、图4。
    荧光特点:
    SyBR  Green  I 监控PCR
    杂交探针监控PCR
    水解探针监控PCR
     方法: 


     临床意义:

    1、用于乙型肝炎及丙型肝炎的常规诊断:
       乙型肝炎:大三阳    80%以上小三阳   20-30%左右,前C区变异丙型肝炎:抗HCV-IgG阳性→筛选HCV-RNA升高→确诊

    2、用于乙型肝炎HBsAg阴性的患者的诊断,乙肝疫苗应答。

    3、用于肝炎病毒基因组的扩增,分子克隆

    4、阐述部分发病机制,指导治疗。
    发病机理:机体→病毒指导临床抗病毒药物的选用
    HBV-DNA浓度变化→病情变化

    5、抗病毒疗效的观察和评价。

     

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